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1.
本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。 相似文献
2.
传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达 总被引：11，自引：1，他引：10
将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。 相似文献
3.
利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段．将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后，用T4 DNA连接酶连接。构建了重组质粒pFastBac-VP1；再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌。在菌体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选。得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1；将Bacmid-VP1转染Sf9细胞．获得重组杆状病毒．并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明，VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。 相似文献
4.
为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆茵中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒.将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性.本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础. 相似文献
5.
为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。 相似文献
6.
为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白，试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因，将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上，构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞，获得P0代重组杆状病毒，经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒，将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养，收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白，通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明：经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带；通过荧光显微镜观察，在转染后第1天就出现绿色荧光，第4～5天出现大量绿色荧光，P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4～5天出现大量绿色荧光；P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现... 相似文献
7.
口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测 总被引：7，自引：0，他引：7
利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究.首先克隆了3D基因片段,将pMD18-3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及Xba Ⅰ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-3D;再将该重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3D;将Bacmid-3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测.经SDS-PAGE和West-ern blot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达. 相似文献
8.
禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。 相似文献
9.
新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达 总被引：3，自引：0，他引：3
为构建杆状病毒转移载体，通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的StuⅠ位点和NP基因上的XbaⅠ位点进行突变，扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAeAB4上，F基因和M基因均在p10启动子的操控之下，NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游，构建重组杆状病毒转移载体pAeAB4-F-NP-M-HN。pAeAB4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBae-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞，72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示：M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达，大小与预期结果一致；感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒，并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。 相似文献
10.
设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBacTM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。 相似文献