天坛株痘苗病毒基因缺失弱毒株的构建及鉴定     

盛媛  王浩然  胡宁宁 《中国兽医学报》2014,(3):384-389

本研究旨在通过敲除部分与天坛株痘苗病毒(vaccinia virus Tiantan strain,VTT)毒力和宿主范围等相关的复制非必需基因,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术,构建多基因缺失VTT弱毒株。人工合成7对重组臂,结合痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein,EGFP),构建穿梭载体质粒pTC-EGFP、pTA35-EGFP、pTA66-EGFP、pTE-EGFP、pTB-EGFP、pTI-EGFP和pTJ-EGFP。将上述质粒依次与VTT或基因缺失VTT共转/感染BHK细胞,并通过同源重组和荧光蚀斑筛选方法,逐一敲除拟缺失基因片段(TC:TC7L^TK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13RTK2L;TA35:TA35L;TA66:TA66R;TE:TE3L;TB:TB13R^TB14R;TI:TI4L;TJ:TJ2R)。利用Cre/Loxp系统实现对外源筛选标记的敲除,最终获得天坛株痘苗病毒基因缺失弱毒株TTVAC7,并运用PCR方法对TTVAC7进行鉴定和遗传稳定性检测。结果表明,本研究成功构建了缺失7个目的片段的天坛株痘苗病毒弱毒株TTVAC7,且该弱毒株具有良好的遗传稳定性。  相似文献   

缺失E3L基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选     

王宇航  李霄  王浩然  阚式绂  王卓越  齐延新  吴娜  杜寿文  金宁一 《中国兽医学报》2011,31(11)

通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子（pE／L）、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp（Locus of X-overP1）序列的表达盒构建穿梭质粒pTE—EGFP。利用pTE—EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞（BHK-21）,通过对绿色荧光蚀斑的10次筛选,构建缺失E31．基因并含有EGFP基因的重组痘苗病毒rTTVV-TE-EGFP＋利用rTTVV—TE-EGFP＋和含有Cre（Cyclization recombination）重组酶基因的重组质粒pVAX1-Cre共转染BHK-21细胞,通过对无荧光蚀斑的10次筛选,构建无筛选标记的天坛株痘苗病毒减毒株rTTVV—TE一,并利用聚合酶链式反应（PCR）对其进行鉴定。鉴定结果显示,rTTVV-TE-中无ESI。基因转录和EGFP基因表达。以上结果说明,所构建的痘苗病毒减毒株rTTVV—TE--完全缺失了E3L基因和外源筛选标记EGFP基因,且具有良好的遗传稳定性。  相似文献   

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建     

刘振江  刘昊  刘燕瑜  郭欢欢  凡敏  岳云强  陆飞  秦艳青  李国江  鲁会军  金宁一 《中国兽医寄生虫病》2011,19(6):25-30

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。  相似文献   

表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒的构建与筛选     

《中国兽医杂志》2020,(6)

为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16)VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病毒遗传稳定性。PCR鉴定结果显示,VP2基因已整合到重组痘苗病毒基因组中,且未扩增出TK基因。荧光显微镜镜下观察,噬斑处均为表达绿色荧光蛋白的病变细胞。本研究成功构建了表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒rVTT-VP2,为后期疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

四联重组痘苗病毒的构建及筛选     

王宏宇  ;徐一鸣  ;盛媛  ;李一权  ;阎富龙  ;赵权  ;李霄  ;金宁一 《兽医大学学报》2014,(9):1411-1415

构建含黄热病毒E基因、汉坦病毒S基因、克里米亚-刚果出血热病毒M基因及炭疽杆菌POAX2基因的重组天坛株痘苗病毒。设计合成含外源筛选标记EGFP基因和4种拟插入外源基因的重组质粒,利用同源重组和荧光标记筛选技术并结合Cre/Loxp敲除系统,最终构建四联重组痘苗病毒。应用PCR对获得的重组痘苗病毒进行鉴定和遗传稳定性的检测,并在电子显微镜下观察其形态特征。构建含4种外源基因的重组痘苗病毒rVTT-C-4＋,该重组痘苗病毒在转录水平上具有良好的遗传稳定性,且于电镜下观察具备完整形态。成功构建四联重组天坛株痘苗病毒,为后续疫苗研究奠定了基础。  相似文献   

表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选     

王建科  张云德  张强  吴国华  颜新敏  朱海霞  李健  邵长春  朱彩珠  吴磊 《畜牧兽医学报》2010,41(4)

为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。  相似文献   

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化     

《中国兽医学报》2020,(2)

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。  相似文献   

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建     

范斌  鲍子磊  贾钦瑞  刘建华  贺笋  冉多良 《中国畜牧兽医》2020,47(8):2652-2659

为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（10^7.1TCID₅₀/0.1 mL）较原毒株（10^8.8TCID₅₀/0.1 mL）下降约10^1.7TCID₅₀/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。  相似文献   

多联重组痘苗病毒的构建及鉴定     

《中国兽医学报》2016,(7)

构建含有埃博拉出血热病毒(Ebola hemorrhagic fever virus,EHFV)小片段分泌蛋白S基因、马尔堡出血热病毒(Marburg hemorrhagic fever virus,MHFV)GP基因、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus,SNV)G2糖蛋白基因及非洲欧尼恩病毒(Africa O’nyong nyong virus,O’NNV)E2蛋白基因的重组痘苗病毒。设计含EGFP筛选标记和4种外源基因的穿梭质粒,并利用同源重组技术、荧光筛选技术和Cre/LoxP敲除系统,最终获得四联重组痘苗病毒。使用PCR方法鉴定重组痘苗病毒及其遗传稳定性;用透射电镜观察病毒形态。结果显示:所构建的多联重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+具有良好的遗传稳定性,并且具备痘苗病毒的完整形态。结果表明:成功构建了含有4种外源基因的重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+,为后续多联疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建     

《中国畜牧兽医》2020,(8)

为筛选马鼻肺炎(equine rhinopneumonitis,ER)基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1(登录号:KF644579.1)目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒(CMV+EGFP+polyA)为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示:经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价(10~(7.1)TCID_(50)/0.1 mL)较原毒株(10~(8.8)TCID_(50)/0.1 mL)下降约10~(1.7)TCID_(50)/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。  相似文献