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1.
【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。 相似文献
2.
鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。 相似文献
3.
【目的】探究四川省猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株流行变异情况,并分析疫苗免疫效果不佳的原因。【方法】从四川某猪场采集仔猪肠道样本进行PCR检测、病毒纯化、病毒滴度测定以及病毒感染等试验;测定分离株全基因组序列,将分离株S基因序列与其他地区毒株及疫苗株进行比对并构建进化树;比较分离株与经典疫苗株CV777 S蛋白氨基酸位点变异情况。【结果】成功分离获得1株PEDV毒株,并命名为PEDV SNJ-P,该毒株病毒滴度为1×107.5/100μL。动物感染试验表明：分离株能引起仔猪出现腹泻和脱水等症状并导致死亡。全基因组测序及遗传进化分析表明：PEDV SNJ-P株全基因共28 003 bp,基因型为S non-INDEL型;与同型的中国分离株PEDV-WS、CH/JLDH/2016和CH/HNLH/2015等毒株亲缘关系较近,与同型的疫苗株亲缘关系相对较远,与经典疫苗株亲缘关系较远。与经典疫苗株CV777相比,SNJ-P株的S蛋白存在多处氨基酸突变、缺失和插入现象。【结论】由于毒株出现变异,SNJ-P株与疫苗株亲缘关系较远,当前所用疫苗无法提供有效保护。本研究结果以期为国内PEDV毒株的研... 相似文献
4.
【目的】探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶基因(HN基因)的分子进化特点,为科学防控新城疫(Newcastle disease,ND)提供依据。【方法】对2008年从陕西省周至县楼观台及其周边地区分离的5个野生鸟类NDV毒株的HN基因进行扩增与测序,与8个国内外不同时期已发表的NDV毒株HN基因进行核苷酸和推导的氨基酸序列的遗传变异分析及分子特性研究。【结果】所有分离株与国内参考强毒株F48E9和国外参考强毒株Herts-33在HN基因C末端终止密码子的位置相同,符合强毒株的特征。从核苷酸和氨基酸同源性来看,分离株与F48E9的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%~99.8%和99.1%~99.7%,与LaSota、B1和clone-30的同源性分别为90.2%~91.8%和87.9%~88.5%,与ZJ1的同源性为84.8%~85.0%和89.3%~89.7%;从系谱进化分析来看,这5个毒株与F48E9关系较近,同属一支,与LaSota、ZJ1、Herts-33等疫苗株和参考毒株关系较远。【结论】该生态区NDV野生鸟类分离株与目前流行的基因Ⅶ型毒株和传统疫苗毒株的关系较远,且具有强毒株的分子特征,因此必须加强该地区野生鸟类新城疫病毒的监测。 相似文献
5.
3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低. 相似文献
6.
【目的】 利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8%—97.1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因,其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300 bp ,而弱毒疫苗株则为250 bp左右;该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增,其敏感性可达到100TCID50/0.1mL,对仔猪腹泻临床样品检测结果显示,PEDV自然感染的阳性率为65.4%。【结论】 初步建立了基于PEDV ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法,该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株,为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。 相似文献
7.
【目的】从临床发病的疑似感染鸡呼肠孤病毒的白羽肉鸡病料中分离鉴定获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,对SD18株进行致病性及传播特性研究,为该病毒的深入研究和综合防治奠定基础。【方法】无菌采集疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物,分离病原物,在LMH细胞上培养,并连续盲传3代,经无菌生理盐水倍比稀释,采用Reed-Muench法测定病毒鸡胚半数致死量(ELD_(50))和组织细胞半数感染量(TCID_(50));对分离毒株进行理化特性和血凝特性测定;利用设计的鸡呼肠孤病毒L1和S1基因特异性引物,对提取的病毒总RNA进行RT-PCR扩增,经PCR鉴定为阳性的菌落进行基因测序以及核苷酸同源性比对和系统遗传进化分析;用该分离株病毒对SPF鸡和白羽肉鸡进行动物回归试验,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定攻毒后的SPF鸡血清中呼肠孤病毒抗体滴度。【结果】从疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物中分离获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,其ELD_(50)为10~(-6.5)/0.1 mL,TCID_(50)为10~(-7.36)/0.1 mL。RT-PCR结果显示,目的基因片段长度分别为1 100,750,265 bp,依次为鸡呼肠孤病毒的S1、σC和L1基因片段。核苷酸同源性比对结果显示,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918(台湾株)的S1基因序列同源性达92.7%,与Ⅰ群鸡病毒性关节炎疫苗S1133株的同源性仅为59.0%。核酸序列遗传进化分析表明,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918(台湾株)处于同一进化分支上,与Ⅰ群鸡源呼肠孤病毒S1133株处于不同的进化分支上,说明新分离的肉鸡呼肠孤病毒SD18株属于基因Ⅴ群,可能是Ⅰ群经典鸡源呼肠孤病毒S1133株的变异毒株。SPF鸡和白羽肉鸡回归试验表明,SD18株病毒能够引起鸡病毒性关节炎,与临床发病一致,并能水平传播。接种试验表明,病毒SD18能致死鸡胚,打开死亡鸡胚可见其绒毛尿囊膜增厚、尿酸盐沉积、胚体出血等症状,符合呼肠孤病毒的致病特点。【结论】该分离株SD18为新型肉鸡呼肠孤病毒,能够引起鸡发生病毒性关节炎。 相似文献
8.
【目的】深入了解2株广西鹅源基因XII型新城疫病毒（NDV）的病原学特征,为NDV流行分布的系统监测和新城疫（ND）的科学防控提供参考依据。【方法】对2株广西鹅源基因XII型NDV（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）进行病毒噬斑纯化,通过致死鸡胚平均死亡时间（MDT）和脑内接种致病指数（ICPI）试验确定其致病性,分析F蛋白和HN蛋白氨基酸序列与参考毒株的差异位点,并基于F基因全长进行遗传进化分析。【结果】经过DF-1细胞4个代次噬斑纯化可获得2株分离株的纯化株,对应的MDT分别为54和48 h,ICPI均为1.65。2株分离株的基因组长度均为15192 nt,其3'端引导序列为55 nt,5'端尾随序列为114 nt;基于F基因核苷酸序列相似性构建的基因XII型NDV系统发育进化树显示,2株分离株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）均属于基因XIIb亚型,与我国广东分离株属于同一基因亚型,且我国2010年的分离株、2011年的分离株及2017年后的分离株分别形成3个小分支。2株分离株的F蛋白裂解位点均为112RRQKRF117,与南美分离株（XIIa亚型）和越南分离株（XIId亚型）相比,在信号肽区域、融合肽区域、七肽重复区和跨膜区共有14个氨基酸差异位点,其中2个氨基酸差异位点（19I→V和294N→S）是广西分离株所特有。2株分离株的HN蛋白跨膜区及抗原中和区氨基酸序列与我国广东分离株均一致,与南美分离株（XIIa亚型）相比存在7个氨基酸差异位点（27V→I、28A→S、34V→I、41A→T、42V→A、263K→R和347E→D）。【结论】我国分离株（XIIb亚型）与南美分离株（XIIa亚型）和越南分离株（XIId亚型）在F蛋白和HN蛋白的氨基酸差异可能与其对鸡群的致病力差异有关。此外,基因XII型NDV一直处于不断进化中,而需持续监测该基因型NDV的流行分布情况。 相似文献
9.
【目的】评估基因Ⅰ型猪乙型脑炎病毒弱毒株(SCYA201201株)作为候选疫苗诱发机体产生细胞免疫的能力。【方法】将基因Ⅰ型猪乙型脑炎弱毒株(SCYA201201株F122代次)腹腔免疫小鼠后使用ELISA检测试剂盒测定早期的INF-γ水平,之后测定INF-γ在小鼠体内的持续时间。【结果】结果显示:猪乙型脑炎SCYA201201弱毒株(F122代次)经腹腔免疫小鼠后,小鼠血清中的INF-γ在免疫后6 h就可上升到一个较高水平,且INF-γ在血清和小鼠脾脏淋巴细胞中均可持续14 d以上。【结论】猪乙型脑炎SCYA201201弱毒株(F122代次)免疫小鼠后能够在早期诱发INF-γ产生,并且能够维持14 d以上,有作为候选疫苗的潜力。 相似文献
10.
【目的】分离鸡传染性支气管炎病毒河南地方株,并对其进行鉴定。【方法】采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用;通过酶处理、病毒干扰试验、动物回归试验、理化试验等研究病毒的特性;利用电镜观察病毒的形态,应用RT-PCR方法扩增分离毒株的S1和N基因片段。【结果】病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚,将病毒盲传至第8代时,病毒的毒力逐渐由104.0增强到107.2;经质量分数1%胰酶处理或用磷酸酯酶C处理的病毒液能够明显凝集质量分数1%鸡红细胞,血凝滴度分别在29和27左右;病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖,单独接种分离毒株的尿囊液HA滴度平均为20,先接种HN99毒株再接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为23,同时接种HN99毒株和NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为28.5,单独接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为29;病毒可致SPF雏鸡发病,引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变;该毒株对乙醚和氯仿敏感,耐酸不耐碱,对热敏感;病毒粒子直径90~105 nm;扩增到了分离毒株S1基因片段大小为1 739 bp(含前导序列),N基因全长为1 230 bp,通过与其他IBV毒株进行系统进化分析,证明分离毒株与其他毒株的亲缘关系较远。【结论】初步证实分离的病毒为肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为HN99株。 相似文献