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布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。 相似文献
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应用PCR扩增羊布鲁菌M5-90株基因组DNA,得到大小为753 bp的Bp-26基因,将其克隆入pMD20-T载体上,测序正确后,构建重组质粒pET-28a-Bp-26,转化到大肠埃希菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导其表达,用Western blot鉴定蛋白.结果表明,成功构建了pET-28a-Bp-26原核表达载体,并在E.coliBL21中表达Bp-26基因,为开展羊布鲁菌Bp-26目的蛋白的抗原性分析和功能研究奠定了基础. 相似文献
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羊泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-T Easy 载体上,经PCR 和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析.随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-MPSP-P32,转化大肠埃希菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确. 相似文献
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《动物医学进展》2020,(8)
布鲁菌Ⅳ型分泌系统是其重要的毒力因子之一,研究其组分中VirB5基因的作用对于阐明布鲁菌的致病机制具有重要意义。应用PCR技术从B.suis S2菌株中扩增VirB5基因,克隆到pMD19T-simple载体,经EcoRⅠ、XhoⅠ酶切,与表达载体pET32a连接,得到重组质粒pET32a-VirB5,测序鉴定正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导并确定最佳诱导条件,采用Ni柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,克隆了717 bp大小的VirB5基因,构建了重组质粒pET32a-VirB5,诱导条件筛选表明,在37℃、菌液OD_(600)值约为0.6时,用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h,蛋白表达量最高,表达的蛋白分子质量约为45 ku,且主要以包涵体的形式存在,研究结果为布鲁菌致病机制的研究提供了材料。 相似文献
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为克隆南阳牛BoLA-DRA基因,构建原核表达载体并研究该基因在大肠埃希菌中的表达。从南阳牛脾脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到BoLA-DRA基因,将其克隆至pGEM-Teasy克隆载体上,转化感受态细胞DH5α,经测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出重组表达质粒,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为917 bp的BoLA-DRA基因,重组质粒pGEX-4T-DRA在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为54.4 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2015,(23)
为了利用特殊表达载体在大肠埃希氏菌中表达融合表皮生长因子(EGF)并进行纯化工艺研究,试验采用PCR扩增EGF,克隆至p ET-SUMO-T载体中,构建重组表达质粒p ET-SUMO-TEGF,转化大肠埃希氏菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的蛋白经SDS-PAGE分析,利用Celating SepharoseTMFast Flow金属螯合层析介质、Q Sepharose High performance阴离子交换层析介质以及Superdex 200 prep grade分子筛对表达蛋白进行纯化,期间采用SephadexTMG-25 Fine介质进行脱盐、SUMO蛋白酶切割His.tag标签。结果表明:重组质粒经PCR鉴定及测序证明构建正确;表达的EGF蛋白分子质量为6 ku,主要以可溶形式表达,表达量占菌体总蛋白的45%以上;纯化的EGF蛋白纯度达到95%。说明成功在大肠埃希氏菌中表达并经过简易工艺纯化了重组EGF。 相似文献
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猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。 相似文献
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获得高纯度具有生物学活性的重组布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,并进行抗原性的分析。将用PCR扩增出的布鲁菌Omp10、Omp25基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32α中,构建pET-32α-Omp10/Omp25原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21（DE3）PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化,分别用Western-blot和间接ELISA检测产物的抗原性。基因测序及酶切鉴定证明pET-32α-Omp10/Omp25原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明,Omp10、Omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达。经过包涵体的变性、复性及亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 000和44 000的融合蛋白,与预测的相对蛋白分子质量一致。Western和间接ELISA试验证明纯化的Omp10、Omp25融合蛋白能被免疫的牛布鲁菌阳性血清所识别。结果表明,成功获得了布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,且均具有一定的免疫原性,通过血清学反应证实,Omp10、Omp25蛋白为布鲁菌病临床诊断试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
10.
采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。 相似文献
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根据GenBank收录的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计并合成了一对VP3基因扩增引物。采用PCR技术对SS/10株的VP3基因进行扩增,将目的基因和原核表达载体PET-32a分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,获得重组质粒PET-32a-VP3,并将其转化表达菌BL21(DE3)pLysS。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了72ku左右的融合蛋白,大部分以包涵体的形式存在于菌体中。Wesern blot结果表明,该蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 相似文献
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通过重叠区扩增法（PCR-based accurate synthesis,PAS）人工合成猪附红细胞体ORF2基因,并使其在大肠杆菌（DE3）中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的ORF2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成ORF2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/ORF2,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。 相似文献
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布鲁氏菌内蒙古分离株omp31基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
对三株布鲁氏菌内蒙古分离株的omp31基因进行克隆与序列分析.参照GenBank中布鲁氏菌的omp31基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增布鲁氏菌omp31基因,对PCR产物进行克隆、测序,将测定序列拼接后与GenBank中获得的参考毒株omp31基因序列进行了比较.结果显示,三株布鲁氏菌分离株的omp31基因开放阅读框核苷酸序列同源性均为100.0%;与Brucella ceti B14/94、Brucella neotomae 5K33、Brucella suis 1330三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最高,为100.0%;与Brucella canis RM6/66、Brucella melitensis 183、Brucella melitensis 16M三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.9%;与Brucella melitensis Rev1参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.6%;与Brucella ovis ATCC 25840参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最低,为98.8%. 相似文献
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狂犬病病毒糖蛋白基因中和抗原表位在大肠杆菌中的串联表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从狂犬病病毒HEP株中克隆狂犬病糖蛋白膜外区全长基因。利用突变PCR方法,将糖蛋白基因中三段中和抗原位点串联,克隆至pET-28a表达载体。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达并确定最佳诱导条件。SDS-PAGE电泳结果显示所表达的蛋白大小与预期相符。经Western-blotting检测,串联表达的狂犬病糖蛋白基因中和抗原位点可与狂犬病标准阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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本试验旨在构建表达猪布鲁菌（Brucellasuis）外膜蛋白0mp25蛋白的真核重组表达质粒,并探讨Omp25蛋白对猪肺泡巨噬细胞生长活性及细胞因子分泌的影响。以猪布鲁菌基因组DNA为模板,设计带有6×His标签的引物克隆Orap25基因,扩增产物克隆入pCI-neo真核表达载体,双酶切及测序鉴定正确后转染猪肺泡巨噬细胞3D4／21,检测其对巨噬细胞生长活性和分泌细胞因子的影响。RT—PCR和Westernblotting检测结果证实Omp25蛋白获得正确表达。显微镜观察细胞形态表明,Omp25蛋白对猪肺泡巨噬细胞的形态无明显影响。MTT结果表明,Orap25蛋白对猪肺泡巨噬细胞的生长活性有轻度但不显著的抑制作用。ELISA检测TNF—α和IL-12蛋白表达水平表明,Omp25蛋白可以显著抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12。本试验成功构建了表达猪布鲁菌外膜蛋白Omp25蛋白的真核重组表达质粒,该蛋白对猪肺泡巨噬细胞的细胞形态没有明显影响,对其生长活性有轻度但不显著的抑制作用,可以显著抑制巨噬细胞分泌TNF—α和IL-12。 相似文献
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根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白Omp38的基因序列设计引物,以Ah J-1株基因组为模板,扩增omp38基因片段,定向克隆至表达质粒pET32 a中,将重组原核表达质粒pET32 a-omp38转化至大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量约35 ku的重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA检测抗体效价为1∶25 600,表明该蛋白有良好的免疫原性。PCR检测表明,omp38基因可在73%(22/30)的嗜水气单胞菌中发现。重组蛋白抗血清与30株嗜水气单胞菌分离株进行凝集试验,所有分离株均可在不同程度上发生反应,表明该重组蛋白是一种潜在的共同保护性抗原,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。 相似文献
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为构建表达新孢子虫重组蛋白SRS2原核表达系统,本研究以新孢子虫基因组为模板PCR扩增SRS2蛋白部分基因,获得大小约为998bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌PET-32a载体中,IPTG诱导重组大肠杆菌,通过SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS—PAGE分析,表达的重组SRS2蛋白分子量约为54kD,免疫印迹结果表明,表达的重组蛋白与牛抗新孢子虫阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究诊断和治疗新孢子虫病奠定了基础。 相似文献
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以表达新疆绵羊种布鲁氏菌外膜抗原蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b,探索其作为诊断抗原和分子疫苗的可能性。采用PCR扩增技术,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组DNA中扩增出OMP2b基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PE-28a(+),构建成重组质粒,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测有无蛋白的表达。结果表明,获得长约1 083bp的PCR片段,序列分析结果与已知绵羊种OMP2b同源性达89.72%;SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量39 ku获得了新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因片段,并在大肠杆菌中实现了表达。 相似文献
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应用RT-PCR技术从新城疫I系疫苗诱导的洛阳土种鸡胚脾淋巴细胞中扩增到全长0.43kb的鸡IL-2基因cDNA,将IL-2cDNA克隆到PMD-T载体,测序结果表明,该基因为不含终止密码子的目的基因。将该目的基因克隆到原核表达载体PET-28a,获得的重组质粒PET-28a-IL2经酶切、PCR及序列测定,表明IL-2基因插入的位点、大小与读码框均正确。PE-28a-IL2在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在14ku处出现一条约占总蛋白21％的蛋白带,表明所克隆的IL2基因在大肠杆菌中得到良好的表达,为进一步研究IL-2的生物学特性奠定了基础。 相似文献
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从采取的新鲜麋鹿血液中提取麋鹿基因组DNA,通过PCR的方法从麋鹿基因组中扩增麋鹿PrP蛋白核心片段的DNA,并分别在引物的5’和3’端引入EcoR I和HindⅢ两个酶切位点,下游引物将原序列TATTAC突变为TAATAA变成两个终止密码子。通过两个酶切位点将麋鹿PrP蛋白核心片段DNA连接到pET-32a(+),转化DH5α,通过酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性克隆送菌液测序,从测序结果分析阳性克隆是否符合要求。测序正确后将核心片段基因连接到pET-32a(+),阳性质粒命名为MPrP-pET-32a(+),阳性质粒转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达、蛋白质纯化鉴定。 相似文献