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1.
本研究旨在构建弓形虫（Toxoplasma gondii）Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2（membrane occupation and recognition nexus protein，MORN2）基因敲除株，探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物，以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板，在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒；在MORN2靶点两翼约500 bp设计同源臂引物，以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因（DHFR）的同源片段；将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中，进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示，试验成功获得MORN2基因敲除株，在体外噬斑试验中，该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致；在体内感染试验中，分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠，小鼠的死亡时间与对照组基本一致，说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能，为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。 相似文献
2.
本研究旨在构建弓形虫(Toxoplasma gondii)Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2(membrane occupation and recognition nexus protein,MORN2)基因敲除株,探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物,以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板,在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒;在MORN2靶点两翼约500bp设计同源臂引物,以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因(DHFR)的同源片段;将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中,进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示,试验成功获得MORN2基因敲除株,在体外噬斑试验中,该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致;在体内感染试验中,分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠,小鼠的死亡时间与对照组基本一致,说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能,为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。 相似文献
3.
鸭疫里默氏杆菌MFS外排泵rant基因缺失株的构建及其介导的耐药性 总被引：1，自引：1，他引：0
旨在构建鸭疫里默氏杆菌rant基因缺失株及回复株,明确MFS外排泵Rant对鸭疫里默氏杆菌耐药性的影响。本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为研究对象,通过自杀质粒pRE112介导的同源重组,以红霉素抗性标记进行正向筛选,获得基因缺失株Δrant,并以大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭质粒pCPRA作为载体,构建回复株cΔrant。采用微量肉汤稀释法测定11类临床常用抗生素对野生株、缺失株及回复株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并测定3株菌的生长曲线,评价菌株对雏鸭的致病能力。结果表明,与野生株和回复株相比,四环素类抗生素对缺失株的MIC值明显下降,其他类抗生素的MIC值无变化;缺失株的生长速率明显下降;rant基因的缺失显著降低鸭疫里默氏杆菌的毒力。结果提示,鸭疫里默氏杆菌rant基因介导四环素类抗生素的外排,并可明显影响鸭疫里默氏杆菌的生长和毒力。 相似文献
4.
为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5（Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5）基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期（速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊）中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。 相似文献
5.
《畜牧与兽医》2020,(8)
弓形虫MIC10基因在速殖子时期与缓殖子时期都存在不同程度的表达,但国内对该基因的研究甚少。为了解弓形虫MIC10基因的功能,构建其原核表达载体,并进行原核表达。本试验以提取的弓形虫DNA为模板,设计引物扩增MIC10基因片段,连接克隆载体pMD-18T和表达载体PGEX-4T-1,PCR和双酶切鉴定后进行原核表达。结果表明,经PCR扩增获得597 bp的MIC10基因片段,构建pMD18-T-MIC10克隆质粒和PGEX-4T-MIC10原核表达载体,经PCR鉴定和双酶切鉴定正确,并在大肠杆菌中成功表达,表达蛋白的分子量约为49 kD。本试验为弓形虫MIC10基因功能的后续研究奠定了基础。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2020,(1):140-146
为研究弓形虫冷休克蛋白2(cold shock domain protein 2 of T.gondii,Tgcsp2)在弓形虫感染宿主过程中的作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫Tgcsp2基因缺失株(ΔTgcsp2)。通过空斑试验和细胞裂解试验探究ΔTgcsp2虫株在体外的生长能力,结果表明ΔTgcsp2虫株的空斑形成能力和细胞裂解能力相对于RH野生株较弱;弓形虫感染细胞要经过入侵、复制和逸出3个过程。为探究Tgcsp2影响体外感染的具体过程,本研究对ΔTgcsp2虫株和RH野生株进行入侵试验、复制试验和逸出试验,结果表明ΔTgcsp2虫株的入侵能力、复制能力和逸出能力都有不同程度的减弱;将ΔTgcsp2虫株和RH野生株感染BALB/c小鼠进行了体内毒力试验;结果表明,与RH野生株相比,ΔTgcsp2虫株对小鼠的毒力减弱。综上所述,Tgcsp2基因对弓形虫体外生长和体内毒力具有重要的作用。 相似文献
7.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(16)
为探讨氟康唑在体外杀灭弓形虫速殖子的效果,抽取感染弓形虫RH株速殖子小鼠腹水,选择活跃的速殖子并稀释至含虫密度为1×105个/m L,加入氟康唑溶液使其终浓度为1.5 mg/m L,以未加药物的相同腹水作阴性对照,加入阿奇霉素的作为阳性对照。应用透射电镜观察药物作用1小时、4小时时虫体超微结构的变化并拍照。结果表明:随着氟康唑作用时间的延长,弓形虫速殖子超微结构逐渐遭到破坏,细胞内容物外溢,最终崩解死亡。相同时间内阿奇霉素作用的速殖子出现细胞膜结构受损,速殖子从头、尾两端开始断裂。说明氟康唑在体外可以杀死弓形虫速殖子,达到了和阿奇霉素一样的效果,且效果与时间有关。 相似文献
8.
【目的】 构建糖基翻转酶gtcA基因缺失株，并阐明其对单增李斯特致病性的影响。【方法】 利用同源重组技术构建gtcA基因缺失株；进一步分析亲本株EGDe-prfA*、缺失株ΔgtcA和回补株CΔgtcA的生长能力；通过Western blotting分析gtcA基因缺失对InlA和InlB在细菌表面锚定的影响；通过DF1细胞黏附侵袭试验、RAW264.7细胞吞噬增殖试验和鸡胚毒力试验评估gtcA基因缺失对单增李斯特菌细胞侵染能力及对鸡胚致病性的影响。【结果】 生长曲线显示，gtcA基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。Western blotting结果显示，内化素InlB在ΔgtcA表面的锚定量极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.01），但其表面InlA的锚定量与EGDe-prfA*并无显著差异（P>0.05）。细胞黏附侵袭试验结果显示，ΔgtcA对成纤维细胞DF1的平均黏附率和侵袭率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05）。吞噬试验结果显示，巨噬细胞RAW264.7对ΔgtcA的平均吞噬率显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA（P<0.05），但ΔgtcA与EGDe-prfA*、CΔgtcA在RAW264.7中的3 h内增殖倍数并无显著差异（P>0.05）。鸡胚毒力试验结果显示，ΔgtcA感染鸡胚肝脏和脾脏中的平均细菌载量分别为6.86×103和3.69×102 CFU，极显著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚（P<0.01）；同时，ΔgtcA感染鸡胚存活率及存活时间均高于EGDe-prfA*和CΔgtcA感染鸡胚。【结论】 糖基转移酶gtcA基因缺失不影响单增李斯特菌1/2a血清型菌株EGDe-prfA*的生长能力，但能显著降低该菌表面InlB的锚定丰度，减弱该菌的细胞侵染能力及对鸡胚的致病性。本研究结果为深入探索糖基翻转酶基因gtcA介导单增李斯特菌致病机制提供参考。 相似文献
9.
弓形虫的生活史可分为有性生殖和无性生殖2个阶段,无性生殖阶段又有缓殖子和速殖子2个阶段,其中速殖子阶段的危害最为严重。作者就速殖子表膜蛋白的相关性、在速殖子和缓殖子转换中的作用、表膜蛋白基团GP1的锚定作用以及表膜蛋白生物工程疫苗方面的研究综述如下。1弓形虫速殖子的表膜蛋白弓形虫速殖子的表膜蛋白大约有1000多种,其中主要的有5种,包括SAG1(P30)、SAG2(P22)、P23、P35和P43。SAG1是速殖子中含量最丰富的蛋白,仅在弓形虫的速殖子期表达。SAG1基因为单拷贝基因,无内含子,弓形虫没有在SAG1基因的转录启动子TATA,在SA… 相似文献
10.
弓形虫P30基因及其功能 总被引：1，自引：0，他引：1
徐大刚 《中国兽医寄生虫病》2002,(3)
弓形虫 P30基因所编码的蛋白为弓形虫主要表面抗原 SAG1 ,其约占速殖子总蛋白量的 5 %,SAG1对虫体侵入宿主细胞及其毒力具重要性 ,并有高度免疫原性和免疫保护性 ,被用于弓形虫疫苗的研制和弓形虫感染的分子诊断 相似文献
11.
弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫，二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用，这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A，通过将其应用于小鼠的免疫保护试验，评估该抗原对弓形虫和新孢子虫感染产生的交叉免疫保护作用。对TgMIC17A进行基因克隆和原核表达，通过免疫印迹试验鉴定其反应原性和交叉反应性。重组蛋白免疫小鼠后测定血清特异性IgG抗体水平，评价其免疫原性。二免后，分别用1×103个弓形虫Pru速殖子、1.5×107个新孢子虫Nc1速殖子攻虫，对小鼠的体重变化、存活率进行监测，并在攻虫30 d后检测各组存活小鼠的脑荷虫量，评价TgMIC17A重组蛋白免疫小鼠后对弓形虫和新孢子虫的交叉免疫保护效果。结果显示，rTgMIC17A可以被弓形虫和新孢子虫的阳性血清识别，相较于未免疫组小鼠，免疫组小鼠体内可产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01)，且感染弓形虫或新孢子虫的脑荷虫量均显著降低(P＜0.01)。本研究克隆并表达了TgMIC17A，鉴定其为新孢子虫和弓形虫的交叉反应抗原。该抗原可以刺激小鼠产生较好的体液免疫反应，并对弓形虫和新孢子虫的感染产生一定的交叉免疫保护作用，可以为弓形虫和新孢子虫共感染的防治，以及筛选具有交叉免疫保护力的重组疫苗提供可借鉴的研究资料。 相似文献
12.
本研究旨在筛选具有抗弓形虫活性的萜类化合物,并进行体外活性评价。对26个萜类化合物进行体外抗弓形虫增殖作用的筛选,采用CCK-8法确定活性化合物对Vero细胞的毒性和安全浓度,Giemsa染色进一步确定对弓形虫的活性,通过细胞免疫荧光、Giemsa染色和生物化学发光法评价活性化合物对弓形虫的体外活性。结果表明,26个萜类化合物中,桧烯对弓形虫有显著的活性,桧烯对RH-2F的IC50为90.76 μg·mL-1,Giemsa染色和细胞免疫荧光的结果表明,桧烯对细胞内的两种弓形虫虫株都有显著的抗增殖作用,并且对弓形虫的入侵有极显著的抑制作用（P<0.001）。综上表明,桧烯对弓形虫的入侵和细胞内增殖具有显著的抑制作用,可作为潜在的抗弓形虫先导化合物。 相似文献
13.
为了分离猫源弓形虫,本试验从云南洱源、怒江两地区捕捉18只野猫,取其心脏、肝脏、肺脏、脑组织用盐酸—胃蛋白酶溶液消化处理后,腹腔接种小白鼠,将分离到的弓形虫虫株至少传3代,用特异PCR方法对所分离的虫株进行鉴定。结果表明,从18只野猫的样品中分离出3株弓形虫虫株,用特异性引物对3株虫株进行PCR鉴定,均得到弓形虫的特异性目的条带,测序结果表明所扩增出的DNA片段确为弓形虫核糖体B1基因部分序列。同源性比对分析结果显示分离株与T.gondii B1的同源性为100.0%。将动物组织用盐酸—胃蛋白酶溶液消化处理后腹腔接种小白鼠是一种分离弓形虫虫株较理想的方法,对弓形虫B1基因进行特异性扩增,可以快速地鉴定弓形虫虫株。 相似文献
14.
LI Hao-xin YAN Hong-ya DUAN Gang XIANG Xun ZHU Qi YANG Zhi-yuan ZU Fei CHANG Hua 《中国畜牧兽医》2016,43(3):825-830
The assay was aimed to isolate Toxoplasma gondii (T.gondii) strains from stray cat in Eryuan and Nujiang of Yunnan province.The cat tissues (heart,liver,lung and brain) were digested by acid pepsin solution,intraperitoneally inoculated in Kunming mice,passaged at least 3 generations,and followed by specific PCR amplification of partial B1 gene using species-specific primers.Three T.gondii isolates were isolated from 18 stray cats,PCR result showed that we got the specific target band,and the sequence result of the specific PCR product showed that it was ribosome B1 gene sequence of T.gondii. Homology comparison analysis showed that the isolates was 100.0% homology with T.gondii B1.The method of inoculation into the mice with the tissues that was digested by acid pepsin solution was an effective way to isolate T.gondii strain from animals,and the specific PCR assay was an accurate method for the rapid identification of T.gondii. 相似文献
15.
本研究旨在对来源于不同宿主和地理分布的22株弓形虫的GRA25基因进行PCR扩增并测序,对获得的GRA25基因序列进行比对,利用MP和ML两种方法对不同分离株的GRA25基因构建系统进化树。利用生物信息学软件将弓形虫RH株的GRA25基因翻译成氨基酸序列,对其编码蛋白的生物学特征进行分析。结果显示,弓形虫GRA25基因序列有2种长度,分别为939和948 bp。序列比对结果显示,GRA25基因在不同虫株间有82个核苷酸变异位点,变异率为0~4.4%。进化分析结果显示,用GRA25基因不能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型虫株。生物信息学分析预测弓形虫GRA25蛋白含有7个亲水区域,10个α-螺旋,3个β-折叠,8个无规则卷曲和8个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。本研究结果表明,GRA25基因不能作为标记分子区分不同基因型的弓形虫虫株,但可能作为疫苗候选分子研制新型抗弓形虫基因疫苗或表位肽疫苗。 相似文献
16.
XU Xiao-pei LIU Wen-ge ZHANG Nian-zhang CHEN Jia ZHOU Dong-hui ZHU Xing-quan XU Qian-ming 《中国畜牧兽医》2016,43(3):650-655
In this study,sequence variation of GRA25 genes among 22 Toxoplasma gondii (T.gondii) strains from different hosts and geographical locations were examined.The complete GRA25 genes from 22 T.gondii isolates were amplified,sequenced,and nucleotide variations were determined.Phylogenetic analysis among the different T.gondii isolates were conducted using maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML) methods.The biological characteristics of the protein GRA25 of the T.gondii RH strain were predicted using bioinformatics software.The sequences of all the examined T.gondii strains were 939 or 948 bp in length.Sequence comparison of all 22 GRA25 sequences identified 82 variable nucleotide positions (0 to 4.4%).The results of phylogenetic analysis showed that strains belonging to the classical typeⅠand Ⅱ could not group into their own branches based on the GRA25 sequences.Bioinformatics analysis revealed that the protein GRA25 contained 7 hydrophobicity regions,10 alpha regions,3 beta sheets,8 random coils and 8 linear B-cell epitopes.These results suggested that the GRA25 gene was not an ideal genetic marker for population genetic study of T.gondii strains,but it might represent a good vaccine candidate against toxoplasmosis. 相似文献
17.
为了解吕氏泰勒虫在中国不同地区山羊和绵羊中的流行情况,本研究应用基于吕氏泰勒虫18S rRNA基因位点的PCR检测方法,对采自中国河南、甘肃、陕西、山西、贵州、云南、新疆7个地区的281份羊血液样品进行检测,并对阳性样品测序以进行序列分析。结果显示,羊吕氏泰勒虫总感染率为35.23%（99/281）。不同采样点羊吕氏泰勒虫感染率差异极显著（P<0.01）,其中河南省羊吕氏泰勒虫感染率最高（98%,49/50）,新疆最低（0）。绵羊和山羊吕氏泰勒虫感染率分别为51.67%（31/60）和30.77%（68/221）,差异极显著（P<0.01）;放牧羊吕氏泰勒虫感染率（41.55%,86/207）极显著高于舍饲羊（17.57%,13/74）（P<0.01）;羊吕氏泰勒虫感染率在春、夏、秋及冬四季分别为56.00%（28/50）、42.75%（59/138）、9.43%（5/53）和17.50%（7/40）,差异极显著（P<0.01）;≥ 12月龄和<12月龄羊吕氏泰勒虫感染率分别为33.50%（67/200）和39.51%（32/81）,差异不显著（P>0.05）。此外,遗传进化分析表明,本研究获得的羊吕氏泰勒虫分离株与中国流行的吕氏泰勒虫分离株同源性高达99.60%以上,且位于同一分支上。本研究为进一步了解中国不同地区羊吕氏泰勒虫的流行现状及分布提供了重要参考依据。 相似文献
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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种重要的人兽共患寄生原虫，具有中间宿主广泛、生活史复杂、传播方式多样、呈全球性分布等特点，可感染几乎所有的恒温动物，导致人兽共患的弓形虫病。弓形虫慢性感染约1/3的世界人口，对免疫缺陷患者、孕妇、孕畜的健康更是造成严重威胁。致密颗粒蛋白是由致密颗粒（弓形虫的一种亚细胞分泌器官）分泌的蛋白质，它们可通过操控宿主（细胞）基因表达、信号通路进而调控宿主细胞的免疫反应和细胞周期，并在蛋白质的转运和定位、营养物质的摄取、纳米管网络（IVN）的形成与稳定性的维持、逸出、慢性感染等生理过程中发挥重要作用。本文综述弓形虫致密颗粒蛋白基本生物学功能的最新研究进展，旨在为深入研究弓形虫的致病机制、鉴定新的抗弓形虫潜在药物靶点和疫苗候选分子提供借鉴。 相似文献
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Dah-Sheng Lin Dwight D. Bowman Richard H. Jacobson 《Comparative immunology, microbiology and infectious diseases》1992,15(4):293-299
Antibodies to antigens of Toxoplasma gondii were measured in the aqueous and cerebrospinal fluid (CSF) of 16 specific-pathogen free kittens experimentally infected with feline immunodeficiency virus (FIV), T. gondii, or both pathogens. The results indicated that all cats infected with T. gondii had antibody responses to antigens of T. gondii in both aqueous fluids and CSF. Co-infection with FIV did not affect antibody levels. Aqueous fluids from eyes of cats with toxoplasmic retinochoroiditis did not necessarily have higher antibody levels than those from eyes without lesions. Antibodies to T. gondii were also detected in the CSF of two cats from whose brains no parasites were isolated by in vivo mouse inoculation. Total IgG did not increase significantly in the aqueous fluids and CSF of cats infected with T. gondii whether or not they were also infected with FIV. 相似文献