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1.
含PRRS病毒ORF5的伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
提取伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）ＢａｒｔｈａＫ６１株基因组ＤＮＡ,用限制性内切酶ＫｐｎＩ充分消化,回收５．９ｋｂ片段（Ｊ片段）,将其克隆于质粒ｐＵＣ１１９ ＫｐｎＩ位点上,获得ｐＢＫＪ。用两对针对ＰＲＶ ＴＫ基因的特异性引物对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定,证明其中含有ＰＲＶ ＴＫ基因。然后用ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱。进一步研究证实ＴＫ基因位于其中的 相似文献
2.
从包含伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）闽Ａ株ＢａｍＨＩ－７片段的重组质粒ｐＰＲ１２８中分离出含有完整糖蛋白ｇｐ５０基因的２．１ｋｂＤＮＡ片段，用ＫｐｎＩ和ＳｔｕＩ酶切后，将其酶切片段分别克隆到ｐＵＣ１９载体中，构建了２．１ｋｂ片段完整测序用质粒。对其序列进行分析，发现与文献报道结果一致，证明分离的ｇｐ５０基因是正确的。将包含ｇｐ５０基因的２．１ｋｂ和１．６ｋｂＤＮＡ片段分别插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的ｐＧＪＰ－５质粒Ｐ７．５启动子的下游，构建了ｐＧＢＴ５０－３６和ｐＧＢＴ５０－Ｓ２２个嵌合载体。将嵌合载体通过磷酸钙共沉淀法转染预先感染ＴＫ＋痘苗病毒天坛株的人ＴＫ－１４３细胞或ＣＶ－１细胞，进行体内同源重组。经蚀斑纯化，在ＢｄＵＲ选择压力下，通过光敏生物素标记的探针杂交，获得带有ＰＲＶｇｐ５０基因的重组痘苗病毒。用ＥＬＩＳＡ检测，重组痘苗病毒有特异性ＰＲＶｇｐ５０抗原存在。 相似文献
3.
伪狂犬病病毒HS株tk基因的PCR扩增与克隆 总被引：5，自引：0，他引：5
参照伪狂犬病病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）ＮＩＡ－３株ｔｋ基因序列,设计并合成１对长２２ｍｅｒ的引物,引物间距１．５ｋｂ,其内包含完整的ＰＲＶｔｋ基因。以ＢＨＫ２１细胞繁殖的ＰＲＶ湖北地方强毒株（ＨＳ－９３０４）基因组为模板进行ＰＣＲ扩增。琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增主带清晰,长约１．５ｋｂ,符合设计要求。扩增片段克隆至由ｐＵＣ１８质粒改制而成的Ｔ载体中,限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切分析证实,扩增片段的酶切位点与ｔｋ基因一致,说明扩增和克隆片段包含ＰＲＶｔｋ基因。 相似文献
4.
采用鸟枪法克隆鸡痘病毒基因组ＢａｍＨＩ部分片段，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＦＰＶ２８２Ｆ４弱毒株ＢａｍＨＩ片段探针点杂交，证实２２个克隆插入了ＦＰＶ２８２Ｅ４弱株ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ片段，选取具代表性的大小不同的６个质粒ｐＵＡ、ＰｕＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＥ、ｐＵＦ。 相似文献
5.
应用ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒构建了含人肿瘤坏死因子－α ｃＤＮＡ的过渡性载体ｐＢＴ１和ｐＢＴ２。用限制性内切酶ＢａｍＨＩ与ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＴ１ＤＮＡ，分离出了ＴＮＦ－α ｃＤＮＡ基因片段，并在其平末端加入了ＢａｍＨＩ接头。进而将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＴＮＦ－αｃＤＮＡ克隆到了逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１５′－端长末端重复序列（ＬＴＲ）下游的ＢａｍＨＩ切点上，构建了重组质粒ｐＺＩＰＴＮＦ。该重组质粒经琼脂糖凝胶电泳，限制性内切酶消化和核酸杂交鉴定分析，证明ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１中插入了ＴＮＦ－α ｃＤＮＡ，并且方向正确。本研究为应用重组逆转录病毒介导ＴＮＦ－α基因转移与治疗奠定了基础。 相似文献
6.
伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建 总被引：7，自引：0，他引：7
用限制性核酸内切酶ＮｃｏＩ消化含有伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｆａ侏ＢａｍＨＩ－７片段的质粒ＰＰＢ７，以低融点琼脂糖回收目的片段，经连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｄ，获得缺失３ｇＩ和部分ｇｐ６３基因的重组质粒ＰＰＢ７－１。将ＰＲＶ Ｆａ与ＰＰＢ７－１ ＤＮＡ共同转染ＰＫ１５单层细胞，待出现５０％以上细胞病变时收获病毒，并以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为ＰＦＤＩ／Ｄ６３。小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定 相似文献
7.
将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞，可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应 相似文献
8.
鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析 总被引：2，自引：1，他引：1
以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。 相似文献
9.
大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建 总被引：13，自引：0，他引：13
用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１,回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段,再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１,与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接,转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。 相似文献
10.
我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT-PCR扩增及其克隆与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶＳ１全基因特异性引物分别从我国华东（ＨＤ）、华北（ＨＢ）、华中（ＨＺ）、华南（ＨＮ）、西北（ＸＢ）及东北（ＤＢ）等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅＩＩ酶切分析及其与英国ＩＢＶＳ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶＳ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５’和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切识别位点的分子修饰之后插入到克隆质粒ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。Ｓ１基因的ＲＦＬＰ分析表明我国ＩＢＶ已有分子水平的变异。 相似文献
11.
伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。 相似文献
12.
A DNA hybridization technique was developed to detect the presence of pseudorabies virus (PRV) DNA. P Nick translated probes of high specific activity were prepared from transformed Escherichia coli plasmids into which Bacillus amyloliquefaciens H (Bam H1) restriction fragments of PRV DNA had been inserted. Swine cellular DNA and tissue culture PRV DNA were digested with Bam H1, separated by agarosegel electrophoresis, transferred onto nitrocellulose paper, hybridized to the radioactive probes, and washed under high stringency conditions; autoradiographs were then prepared. Under the optimal hybridization conditions described, the detection limit of these probes was 10(-11)g of PRV DNA. In reconstruction experiments, 3 of the selected probes cross hybridized with digested swine cellular DNA, and 4 probes did not. The addition of polyuridylic acid and polyguanylic acid to the hybridization reactions did not alter the amount of hybridization. The results indicated that this procedure may be useful for studying the latency of pseudorabies viral infection. 相似文献
13.
将来自质粒pFSV40的300bpBamHI/PstI片段[其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中，获得重组质粒USKSV40。该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.1( )的946bpBglⅡEcoRI片段（其中含CMV启动子及部分多克隆位点）插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点，构建了通用载体pPRVCMV-uni，其中含有CMV启动子，SV40poly(A)以及NheI,Pme1,BamHI,BstXI,EcoRI,StuI,XbaI等7个单一克隆位点，将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间，用所获得的转移载体与TK/gG-/LacZ^ PRV基因组共转染PK-15细胞，经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达，从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。 相似文献
14.
The restriction endonuclease DNA fingerprints of 57 isolates of equine herpesvirus 1 (EHV1; equine abortion virus) from abortion, perinatal foal mortalities and encephalitis from 15 epidemics that occurred in Australasia between 1975 and 1989 were examined using the enzymes Bam HI, EcoRI and Bgl II. There was a remarkable degree of uniformity in the restriction patterns; mobility differences were observed in only 14 of 52 (27%) of the fragments. Twelve of these 14 fragments were located within the repeat structures that bracket the unique short region of the genome or were located at the left terminus of the 150 kilobase pair genome. Based on the Bam HI fingerprints the commonest virus identified in our study was EHV1.IP (P is for prototype strain). There was a single notable exception in that the Bam HI fingerprints of all 8 isolates from one of 3 Victorian farms that experienced abortion in 1989 resembled a variant EHV1.IB that was identified as a cause of abortion in Central Kentucky in 1970 to 1974. We present evidence that EHV1.IB caused abortion in California in 1964 and has remained unaltered in its Bam HI restriction pattern. No antigenic differences were found among 4 distantly related EHV1 isolates, including the variant IB, using a panel of 5 monoclonal antibodies to glycoprotein C (gC), a glycoprotein recognised to be highly variable. The uniformity of these unrelated EHV1 isolates is further evidence for a recent origin for EHV1 and may help to explain the natural history of this virus in the horse in which it seems to be a cause of serious epidemics of abortion and perinatal mortality, and less commonly of encephalitis. 相似文献
15.
本研究以pAT153质粒为载体,构建了小肠结肠耶氏菌毒性质粒(pVYE)经限制性内切酶Bam HI和PstI消化产生的DNA片段的基因文库.实验克隆了8株(pYBI～8)pVYE的BamHI片段和6株(pYPI～6)pVYE的PstI片段的重组子.其中pYB4、pYB7、pYB8重组质粒中插入的pVYE—Bam HIDNA片段的分子量分别为8.7、3.8、20kb;pYP3、pYP5、pYP6重组质粒中插入的pVYE-Pst I DNA片段的分子量分别为4.5、3.0、7.0kb.本实验结果为进一步筛选和制备特异性基因探针奠定了基础. 相似文献
16.
A human major histocompatibility complex (MHC) class II (DR-β) probe was hybridized with restriction enzyme digest of genomic DNA from 14 goats. Nine of the animals belonged to one family. Digestion of the DNA with the restriction enzyme Eco RI gave 7 fragments in 13 animals and 6 fragments in the last animal. No other polymorphism could be detected. Bam HI digestion gave from 3 to 6 fragments which displayed a considerable polymorphism. In the family studied, polymorphic fragments were inherited together with serologically defined lymphocyte antigen specificities believed to be coded for by MHC class I genes. 相似文献
17.
根据Genebank中伪狂犬病毒Min-A株gE基因序列,设计了一对引物,PCR扩增长度为557bp的gE基因去信号肽后的主要抗原区域(157-714bp),将其克隆进测序载体PGEM-Teasy中,成功构建质粒PGEMTeasy-gE。用BamhI和HindIII将gE基因主要抗原区域从PGEM-Teasy中切出,然后与同样酶处理的原核表达载体PET32A连接,命名为PET-gE。在IPTG的诱导后,经SDS-PAGE电泳发现43ku处出现特异性蛋白条带。经过Western blot分析,表达产物具有很好的免疫原性。该研究成功表达出具有抗原性的目的蛋白,为血清学鉴别诊断方法gE-ELISA的建立打下很好的基础,同时gE-ELISA也能对野毒和疫苗毒进行鉴别。 相似文献
18.
Bacteroides nodosus involved in several outbreaks of ovine footrot over a number of years were subjected to DNA restriction endonuclease analysis. Individual isolates were found to have characteristic Bam HI profiles which permitted their accurate identification and differentiation from other isolates. Bam HI profiles of B. nodosus isolates were used in epidemiological investigations involving consecutive outbreaks of footrot on individual and neighbouring farms. The relationship of given isolates to a common source could be established by this means. Restriction endonuclease analysis provides an additional epidemiological tool in ovine footrot investigations as it accurately identifies interstrain differences in a manner not possible by conventional bacteriological and serological means. 相似文献
19.
对我国鸡痘病毒 ( FPV) 2 82 E4株基因组 2 .9kb Bam HI片段进行了序列测定与分析。结果表明 ,该片段全长 2 92 3 bp,A T含量为 72 .0 8%,含 6个完整的开放读码框架 ( ORF)和 2个不完整的 ORF,最大的ORF所编码多肽的相对分子质量为 2 4 60 0。在 2个 ORF的上游存在痘苗病毒晚期启动子的保守序列TAAAT,在 6个 ORF的下游和 2个 ORF的编码区内存在痘苗病毒早期转录终止信号 T5NT。把该片段的核苷酸序列和每个 ORF所编码的氨基酸序列分别对 EMBL核酸序列库和 SWISS-PROT蛋白质序列库进行了同源性搜索 ,未发现同源性片段 相似文献