共查询到19条相似文献，搜索用时 651 毫秒
1.
猪2型圆环病毒与O型口蹄疫病毒二联重组鸡痘病毒的构建和筛选 总被引：2，自引：1，他引：1
以pUTA2LacZ为真核表达载体,以中国流行株O型口蹄疫病毒(FMDV)NY00株结构蛋白前体P1基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和复制蛋白基因为目的基因,构建了2个重组质粒作为中间转移质粒,标记为pUTALP1-ORF2和pUTALP1-ORF20RF1.将这2个重组转移质粒分别酶切鉴定后,与鸡痘病毒野毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞.结果显示,重组核酸质粒构建正确,并能进行表达.经5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)加压筛选,挑取单个蚀斑,3次纯化,获得2株重组毒vpUTALP1-ORF20RF1和vpUTALP1-ORF2.结果表明,这2株重组鸡痘毒在电镜下可形成完整的病毒粒子. 相似文献
2.
以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
3.
共表达新城疫病毒F基因、传染性法氏囊病病毒VP0基因的重组鸡痘病毒的抗原性和免疫原性 总被引：11，自引：2，他引：9
以鸡痘病毒(FPV)282E4株TK基因为侧翼,将2个相同的复合启动子ATI@p7.5×20以反向方式连接,分别调控新城疫病毒(NDV)F基因和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP0基因,得到重组转移质粒pVP0-2ATI@p7.5×20F.然后将该重组转移质粒用脂质体转染预先感染FPV 282E4株的鸡胚成纤维细胞(CEF),在经BrdU(5-溴-脱氧尿嘧啶)加压处理后的CEF上传代,用间接免疫荧光试验、Western blot检测,有2株鸡痘病毒能同时表达NDV F蛋白和IBDV VP0蛋白.用这2株重组鸡痘病毒刺种商品Leghorn雏鸡,于刺种前及刺种后1、2、3周对抗NDV特异性抗体水平和淋巴细胞转化能力检测,结果发现,重组鸡痘病毒能激发机体产生良好的免疫反应.结果表明,重组鸡痘病毒可以作为疫苗备选株进行研究与开发. 相似文献
4.
参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2。将重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmid-ORF2、rBacmid-ORF5、rBacmid-ORF5-ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。 相似文献
5.
利用BrdU在CEF(TK~ )细胞中筛选TK~-重组鸡痘病毒 总被引：1，自引：0，他引：1
将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK )细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的 TK-重组鸡痘病毒 相似文献
6.
利用BrdU在CEF（TK^＋）细胞中筛选TK^—重组鸡痘病毒 总被引：7，自引：2，他引：5
将新城疫病毒（NDV）四平株HN基因，插入不含报告基因，以TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体pUTA-2中的复合启动子下游，获得重组表达质粒pUTA-2HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒（FPV）感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），培养、收获病毒后，用含40mg/L5－溴－2－脱氧尿嘧啶（BrdU)的培养液，在CEF（TK^ )细胞中筛选培养2代，然后用不含BrdU的培养液进行病毒蚀斑纯,化成功筛选出表达NDV HN蛋白的TK^-重组鸡痘病毒。 相似文献
7.
将含痘病毒启动子LP2EP2的鸡传染性支气管炎病毒S1糖蛋白基因和鸡IL-18(ChIL-18)基因同时插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组禽痘病毒转移载体pSYS1/ChIL-18。用脂质体将其转染已感染禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达S1和鸡IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-S1-ChIL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,对重组病毒rFPV-S1-ChIL-18进行多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用S1基因和鸡IL-18基因特异引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb和1条约0.6 kb的带。经间接免疫荧光法和T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1和鸡IL-18。 相似文献
8.
禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达 总被引：6，自引：2，他引：4
为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。 相似文献
9.
《中国预防兽医学报》2018,(12)
为研究表达鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因重组禽痘病毒的抗病毒活性,本研究构建了在禽痘病毒(FPV)早晚期启动子LP2EP2控制下的IFN-γ基因重组禽痘病毒转移载体,将其转染至亲本禽痘病毒S-FPV-017预感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF),使其与禽痘病毒基因组进行同源重组,经过9轮筛选和纯化并进行PCR和间接免疫荧光检测,获得能稳定表达外源基因的重组病毒r FPV-IFNγ-LacZ。利用细胞病变抑制法检测抗病毒活性结果显示,在鸡胚成纤维细胞中重组禽痘病毒表达的IFN-γ对鹅细小病毒的复制具有显著抑制作用。本研究为制备共表达保护性抗原和γ干扰素基因的重组基因工程疫苗研究奠定基础。 相似文献
10.
将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。 相似文献
11.
为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5.经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白.免疫SPF小鼠,检测鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平.结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫. 相似文献
12.
为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。 相似文献
13.
为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni2+离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。 相似文献
14.
本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表明,重组鸡痘病毒能够刺激免疫鼠产生特异性PRRSV ELISA抗体,促进特异性T淋巴细胞增殖。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IFN-γ的分泌显著提高。结果表明,所构建重组鸡痘病毒可以对小鼠起到良好的免疫效果,具有成为抗PRRSV感染新型疫苗的潜力。 相似文献
15.
Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2 总被引：15，自引：0，他引：15
Porcine circovirus type 2 (PCV2) is associated with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Pseudorabies (PR) is also an important infectious disease in swine and sometimes co-infect with PCV2. An attenuated pseudorabies virus (PRV) has been successfully used as a vector for live viral vaccines. In this study, a recombinant PRV expressing ORF1-ORF2 fusion protein of PCV2 was constructed and its immunogenicity was tested in mice and pigs. The ORF1 and partial ORF2 gene of PCV2 Yu-A strain were amplified by PCR and inserted into a transfer vector. The recombinant transfer plasmid was co-transfected with the EcoRI digested genome of vector virus (PRV TK-/gE-/LacZ+) into IBRS-2 cells. The recombinant pseudorabies virus PRV-PCV2 was purified by plaque purification and identified by PCR and Southern blotting. Expression of the ORF1-ORF2 fusion protein by the recombinant PRV-PCV2 virus was demonstrated by Western blotting analysis. The growth properties of the recombinant virus in cells were similar to that of the parent vector virus. In animal experiments, PRV-PCV2 elicited strong anti-PRV and anti-PCV2 antibodies in Balb/c mice as indicated by PRV-neutralizing assay, anti-PCV2 ELISA and PCV2 specific lymphocyte proliferation assay, respectively. And PRV-PCV2 immunization protected mice against a lethal challenge of a virulent PRV Ea strain. In pigs, PRV-PCV2 elicited significant immune response towards PRV and PCV2 as indicated by PRV-ELISA, PRV neutralizing assay and PCV2 specific lymphocyte proliferation assay, respectively. This is a first step toward the development of a potential candidate divalent vaccine against PRV and PCV2 infections. 相似文献
16.
猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析 总被引：3，自引：2，他引：1
为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
17.
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料中扩增出了ORF3基因,将其克隆到高效真核表达载体pEGFP- N2中,筛选出含有ORF3基因的重组质粒,命名为pEGFP-N2-ORF3.对此重组质粒进行测序分析,结果表明,克隆的ORF3基因与其他PCV2的ORF3核苷酸序列相似性为96.2％-99.0％,氨基酸序列同源性为90.5 ％～98.1％.将重组质粒纯化后转染COS-7细胞,用PCR方法扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光,结果转染pEGFP- N2-ORF3重组蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性.本研究为进一步探讨ORF3的结构和功能提供理论依据. 相似文献
18.
猪圆环病毒与口蹄疫病毒二联重组鸡痘病毒的鉴定和BALB/c小鼠的免疫试验 总被引：1，自引：0，他引：1
以鸡痘病毒(FPV282E4)为活载体,用猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白、与复制相关蛋白基因及O型口蹄疫结构蛋白基因作为目的基因,经同源重组的方法获得2个重组鸡痘毒,分别命名为:vUTALP1-ORF2-ORF1、vUTALP1-ORF2。在复制、转录和翻译水平对这2个重组毒进行鉴定,结果表明这2个重组毒均能表达目的蛋白。将它们免疫6～8周龄BALB/c小鼠,每隔19d免疫1次,共3次;每10d尾跟采血1次,三免后10d杀鼠取脾。用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量。结果发现2个重组毒试验免疫组均是从最后一次采集的小鼠血清能获得最高的抗体效价,与对照组FPV相比都能产生一定的体液免疫反应,且以vUTALP1-ORF2-ORF1重组毒免疫小鼠产生的血清抗体效价最高;脾T淋巴细胞亚类数量测定发现,免疫试验组的CD4+与CD8+的T细胞亚类总数显著高于对照组(P0.05),并以vUTALP1-ORF2-ORF1数值较高。结果表明,这2个重组鸡痘毒既能较好的刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫,将作为候选活载体重组鸡痘毒进行本体动物免疫试验研究。 相似文献