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1.
塞内卡病毒A（SVA）与口蹄疫病毒（FMDV）引起猪的临床症状难以区分,并且以SVA作为载体插入FMDV抗原表位外源基因的研究,目前还没有报道。为了构建一种嵌合FMDV抗原表位的重组SVA毒株并进行鉴定,本研究利用基因克隆技术将O型FMDV的B细胞表位与白蛋白信号肽（human albumin signal peptide,HAS）基因串联插入到SVA基因组中,成功构建了重组质粒,转染细胞后拯救出重组病毒rSVA-HAS-OB。结果显示：RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入;细胞间接免疫荧光和Western blot鉴定了嵌合抗原蛋白的有效表达;遗传稳定性分析表明重组病毒在25代次的传代过程中仍稳定存在B细胞表位;病毒蚀斑表型和一步生长曲线结果表明,重组病毒与亲本毒株具有相似的增殖特性。本研究成功构建并拯救出能够表达FMDV抗原表位的重组SVA毒株,为以SVA为基础的嵌合病毒及疫苗的研究提供了理论和实验基础。 相似文献
2.
为探究猪塞内卡病毒A(SVA)感染、干扰素(IFN-α)处理对猪肾细胞(PK-15)微RNA(microRNA,miRNA)转录谱的影响，本研究分别构建SVA感染的PK-15(PK-15/SVA)、IFN-α处理的PK-15 (PK-15/IFN),SVA感染再经IFN-α处理的PK-15细胞(PK-15/SVA/IFN)，通过荧光定量PCR(qPCR)分别检测各组细胞中SVA VP1及IFN-αm RNA的转录水平。结果显示，与PK-15相比，PK-15/SVA及PK-15/SVA/IFN细胞中SVA VP1基因的转录水平极显著升高(P<0.001),PK-15/SVA/IFN中IFN-α的转录水平显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01)。通过转录组测序技术(RNA-Seq)分析各组细胞mi RNA的转录谱，采用Spss软件统计各组细胞中转录差异miRNA的数量；利用基于负二项分布的DESeq2筛选各组细胞中转录显著差异mi RNA；采用miRanda、PITA和RNAhybrid 3个软件预测各组细胞转录显著差异miRNA的靶基因，通过miREvo和mird... 相似文献
3.
塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒，该病毒在我国流行范围越来越广，对养猪业造成了巨大经济损失。为提高灭活疫苗的免疫效果，本研究以SVA感染性克隆为基础，将猪源GM-CSF-T2A基因通过融合PCR方法插入到SVA的2A和2B之间，成功构建了重组质粒SVA-GM-CSF,将其转染BHK-21细胞进行病毒拯救及传代。结果显示，重组病毒感染BHK-21细胞可以引起明显的细胞病变；经RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入；间接免疫荧光鉴定表明外源基因GM-CSF在该病毒中成功获得了表达。生物学特性分析表明，重组病毒与亲本病毒在BHK-21细胞中具有相似的生长特性，并且该重组病毒在传代过程中具有良好的遗传稳定性。本研究已成功构建了稳定表达GM-CSF的重组SVA,该重组病毒的构建为进一步明确SVA致病机制和研制新型疫苗提供了理论支持与技术指导。 相似文献
4.
构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路. 相似文献
5.
前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130,将重组转移载体转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs),以ASFV CN/GS/2018为亲本毒株感染BMDM,在β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的条件下,经绿色荧光和PCR鉴定,获得条件性敲除D1133L重组毒株vD1133Li。利用荧光显微镜观察该重组毒株与亲本毒株在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的复制差异,利用qPCR技术比较重组病毒与亲本毒株的复制差异,分析vD1133Li在无IPTG情况下回补D1133L蛋白后与在IPTG诱导情况下的复制差异。结果显示：本研究成功构建了条件性敲除D1133L的ASFV重组病毒vD1133Li,重组毒株不表达D1133L,在IPTG诱导下复制能力显著低于亲本毒株;在稳定表达D1133L的MA-104细胞系中,vD1133Li复制能力恢复。综上所述,D1133L基因对于ASFV复制至关重... 相似文献
6.
A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。 相似文献
7.
为了构建表达双外源基因的重组新城疫病毒载体,试验采用分子生物学方法对重组新城疫病毒进行了研究。通过反向遗传学操作构建并拯救表达双基因的重组新城疫病毒[r Clone30-EGFP(NP/P)-RFP (P/M)];用重组新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞并绘制生长曲线;通过免疫荧光试验检测重组新城疫病毒感染HepG2细胞后荧光蛋白的表达情况。结果表明:试验成功构建并拯救了表达双基因的重组新城疫病毒;重组新城疫病毒的生长动力学与亲本病毒相似,差异不显著(P0. 05);重组新城疫病毒能够在HepG2细胞中稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)。说明重组新城疫病毒感染HepG2细胞后可稳定表达双外源基因。 相似文献
8.
本研究旨在建立中国流行株人免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白(Gag)哺乳动物稳定表达细胞系。将HIV-1核心蛋白基因gag和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP依次串联插入反转录病毒载体pFB-neo,构建重组反转录病毒载体pFB-gag-EGFP,并与含有辅助病毒gag-pol和env基因的质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装出的反转录病毒感染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP表达,验证HIV-1核心蛋白Gag表达,G418抗性筛选阳性细胞。结果表明,HIV-1核心蛋白Gag和增强型绿色荧光蛋白可在SP2/0细胞中稳定表达,HIV-1核心蛋白gag基因稳定表达细胞系成功建立,为抗AIDS治疗用基因工程制剂及靶向药物的活性检测提供了理想方法。 相似文献
9.
旨在构建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒（FMDV）和塞内卡病毒（SVA）复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA（sg RNA）,合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹（Western blot）方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2020,(2)
根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。 相似文献
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【目的】从天然产物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的天然产物并研究其颉颃作用机制。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)与BHK-21细胞,结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA药物体外筛选平台。从天然产物库中筛选浓度为10μmol/L时具有抑制荧光素酶活性效应的天然产物,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR验证其抑制活性,通过细胞毒性试验确定其最大无毒浓度。选择病毒感染周期的吸附、入胞、复制、组装释放4个主要过程,利用实时荧光定量RT-PCR、50%组织细胞感染量(TCID50)测定等进行天然产物分子颉颃机制研究。【结果】从包含560种天然产物的分子库中筛选出16种候选抗SVA活性分子,通过实时荧光定量RT-PCR及细胞毒性检测,鉴定出4种安全、有效的天然产物,分别为20S-原人参三醇((20S)-protopanaxatriol)、蕈青霉素(paxilline)、方胆碱(fangchinoline)、竹红菌乙素(hypocrellin B)。作用机制研究显示,20S-原人参三醇能抑制SVA感染过程中的... 相似文献
12.
Chen HC Yang SH Kuo TY Lai SS 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2011,73(8):1097-1100
This study described construction and transfection of an EGFP-fused Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) genome and the recovery of the virus. Posttransfection, PCV2 (ORF1)-EGFP/pSK, PCV2 (ORF3)-EGFP/pSK, PCV2 (ORF4)-EGFP/pSK and PCV2(ORF5)-EGFP/pSK showed no fluorescent signals in transfected cells, while green fluorescent signals were observed in the nuclei of PK-15 cells after PCV2 (ORF2)-EGFP/pSK transfection. The presence of ORF2-EGFP fusion protein was demonstrated by dual signals of green fluorescence and anti-PCV2 antibodies conjugated with rhodamine in an immunofluorescence assay (IFA). Furthermore, the released EGFP-fused PCV2 genome was demonstrated by real-time PCR. 相似文献
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为了分析猪源新城疫病毒F和HN基因对BHK-21细胞膜的融合作用,采用RT-PCR方法从猪源新城疫病毒JL01株中扩增获得了F蛋白基因,并根据GenBank上登录的猪源新城疫病毒HN基因序列,合成了HN基因,分别将F和HN基因克隆到pKS载体上。又从大肠杆菌BL21（DE3）中扩增得到T7RNA聚合酶基因,将报告基因EGFP与T7RNA聚合酶基因一起定向克隆到痘苗病毒转移载体pSTK上。再将pKS-F、pKS-HN与pSTK-T7-EGFP共转染BHK-21细胞,转染后16h,用Giemsa染液进行染色,可见明显的细胞融合现象。该研究证明猪源新城疫病毒JL01株的F和HN蛋白共同作用于BHK-21细胞使细胞膜融合。 相似文献
14.
为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽VP22与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-EGFP）,以及细胞渗透肽VP22与3种弓形虫抗原融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-SAG1、pcDNA-VP22-GRA4、pcDNA-VP22-AMA1）。经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定后,将重组质粒pcDNA-VP22-EGFP转染COS7细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR检测,验证VP22-EGFP基因在COS7细胞中的表达情况。PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定结果显示所有重组质粒均构建正确。转染72 h后的细胞,在荧光显微镜下成功观察到绿色荧光。RT-PCR扩增得到了大小为1 449 bp的目的条带,与预期结果一致。结果表明,重组质粒构建成功。 相似文献
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WANG Na LIU Yan-shuang LIU Ning JIN Chao ZHANG Xi-lu JIN Yue XUE Shu-jiang 《中国畜牧兽医》2016,43(11):2859-2865
To study a novel vaccine of Toxoplasma gondii,the recombinant plasmids that cell penetrating peptides VP22 gene fused with one enhanced green fluorescent protein（EGFP)(pcDNA-VP22-EGFP)and three antigens of T.gondii（pcDNA-VP22-SAG1,pcDNA-VP22-GRA4 and pcDNA-VP22-AMA1）were constructed,respectively.The recombinant plasmids were identified by PCR,restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.The pcDNA-VP22-EGFP plasmid was transfected into COS7 cells,and the expression of VP22-EGFP in COS7 cells was confirmed by fluorescence microscope and RT-PCR.The results showed that all recombinant plasmid were constructed correctly.Green fluorescence was observed successfully under the fluorescence microscope in transfected cells after 72 h.The gene fragment of 1 449 bp was obtained by RT-PCR.The results indicated that the recombinant plasmids were constructed successfully. 相似文献
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猪瘟兔化弱毒疫苗C株是我国自主研发的,用于预防猪瘟（CSF）的最好弱毒活疫苗。然而,现阶段的C株不具备标记功能,无法区分野毒感染与疫苗接种。本研究旨在将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因插入猪瘟病毒（CSFV）C株将其构建为报告病毒,为C株的基础研究提供病毒示踪工具,同时提供构建标记C株疫苗的方法。本研究中,笔者在CSFV C株中引入EGFP基因,分别构建了表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的报告CSFV rHCLV-EGFP,以及用CSFV强毒Shimen（SM）株Npro基因替换C株Npro基因后再引入EGFP基因的嵌合报告病毒rHCLV-Npro（SM）-EGFP。通过猪瘟抗原ELISA检测,直接观察荧光及Western blot检测EGFP的蛋白表达等方法对拯救的病毒进行鉴定,并在细胞和家兔上评价这两株病毒的生物学特性。结果显示,两株报告病毒的抗原ELISA结果均为阳性;在感染rHCLV-EGFP的细胞中并未观察到绿色荧光也未检测到EGFP蛋白,但在感染rHCLV-Npro（SM）-EGFP的细胞中观察到EGFP的绿色荧光并检测到EGFP蛋白;细胞试验结果表明,两株报告病毒与亲本病毒具有相似的生长特性且遗传稳定;家兔试验发现,rHCLV-Npro（SM）-EGFP保留了C株的在家兔体内的生物学特性,但rHCLV-EGFP失去了C株诱导家兔定型热反应的能力。构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro（SM）-EGFP可以作为C株的报告病毒进行应用：可以对病毒示踪,用于研究C株的复制过程、病毒与细胞的相互作用;同时,该嵌合报告病毒也具备发展为标记C株疫苗的潜力。 相似文献
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为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。 相似文献