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为建立动物源性食品中沙拉沙星（SAR）残留的快速检测方法,本试验通过对盐酸沙拉沙星进行分子改造和偶联蛋白合成完全免疫原,免疫小鼠制备SAR单克隆抗体。通过棋盘法确定最佳包被原浓度及一抗稀释度,优化确定最佳反应条件,从而建立间接竞争化学发光酶联免疫（ic-CLEIA）检测方法,并通过灵敏度、精密度、交叉反应率、添加回收试验对该方法进行评价。紫外扫描结果显示,完全免疫原偶联成功;制备的SAR单克隆抗体效价达1：4×106;包被原浓度为0.25 μg/mL,抗体稀释比为1：750 000,4 ℃包被过夜,5%脱脂乳封闭,竞争孵育1 h,酶标二抗稀释比为1：10 000,孵育1 h为ic-CLEIA最佳反应条件;建立的ic-CLEIA方法标准曲线呈线性,线性范围为0.0625~10 ng/mL,R2=0.995,灵敏度IC50为1.45 ng/mL;其平均批内和批间变异系数均<10%;除与二氟沙星的交叉反应率达到98.08%以外,与其他氟喹诺酮类药物的交叉反应率均<8%,与其他非氟喹诺酮类药物均无交叉反应;SAR标准溶液的最低检测限（LOD）为0.32 ng/mL,SAR在鸡肉样品中的LOD为0.46 μg/kg;添加回收率在88.3%~106.7%范围内,其变异系数≤12.2%。结果表明,本研究建立的ic-CLEIA方法检测速度快、灵敏度高,适用于动物源性食品中SAR残留的大量检测,为SAR残留检测提供了新的方法。 相似文献
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本试验旨在探究脱氧雪腐烯醇（DON）对牛卵母细胞体外成熟发育的影响及其作用机制。将牛卵丘卵母细胞复合体分别在含DON浓度为0、50、250、500、1 000 ng·mL-1的体外成熟培养液中进行体外成熟,检测卵丘细胞扩展程度及第一极体排出率,构建DON毒性模型。然后,借助此模型研究DON对卵母细胞的线粒体分布及后续受精卵裂率、囊胚发育率的影响,探究DON对牛卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响;通过检测体外成熟卵母细胞内的氧化相关因子（ROS、GSH）水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表达量,揭示DON影响牛卵母细胞体外发育能力的分子机制。结果表明,250、500 ng·mL-1的DON显著抑制卵母细胞的第一极体排出（P<0.05）,1 000 ng·mL-1的DON极显著抑制第一极体排出（P<0.01）; 250 ng·mL-1的DON显著抑制卵丘卵母细胞扩展（P<0.05）,500、1 000 ng·mL-1的DON极显著抑制卵丘细胞扩展（P<0.01）;后续试验选取DON浓度为500 ng·mL-1作为毒性模型（DON组）,与不含DON组（对照组）进行比较研究,结果发现,对照组与DON组的线粒体均匀分布比例（60.2%vs.40.0%）存在显著差异（P<0.05）;试验组较对照组的受精卵裂率（33.6±3.6%vs.（67.7±2.6）%）及早期囊胚率（（0.0±0.0）%vs.（18.3±2.2）%）均显著降低（P<0.05）;试验组较对照组,卵母细胞内ROS水平（1.6 vs.1.0）显著升高（P<0.05）,GSH相对水平（0.4 vs.1.0）显著降低（P<0.05）,抗氧化基因CAT与GPx4的mRNA相对表达量（0.0 vs.1.0;0.6 vs.1.0）显著降低（P<0.05）。以上研究表明,DON对卵母细胞的体外成熟及早期胚胎发育具有抑制作用,其作用机制与DON破坏牛卵母细胞内抗氧化系统平衡相关。 相似文献
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弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种人畜共患机会性致病原虫，其急性感染可导致宿主产生明显的临床症状和严重的病理损伤。弓形虫致密颗粒蛋白1（dense granuleprotein 1，GRA1）是一种良好的诊断抗原，也是弓形虫急性感染的标志物循环抗原（circulating antigen，CAg）的重要组分。本研究利用TgGRA1单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA方法，为急性弓形虫感染的检测提供依据。将免疫GRA1-His的小鼠脾细胞与SP2/0进行融合，筛选出能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。选择其中一种单抗与HRP标记后的鼠源GRA1多抗配对，建立1种双抗体夹心ELISA方法，检测人工感染弓形虫的猪和小鼠血清样品，并将检测效果与巢式PCR（nest PCR，nPCR）和商品化试剂盒进行比较。结果筛选到4株杂交瘤细胞，腹水效价为106~107，亚型均为IgG1；IFA和Western blot结果显示，4株单抗均具有良好的反应性和特异性。选择1G2单抗和HRP标记多抗配对，建立了循环抗原双抗体夹心ELISA方法，最低能够检测到血清中1.563 ng·mL-1 GRA1抗原，或者100 ng·mL-1 ESA。该方法与nPCR相比具有较高的一致性，较市售商品化试剂盒更为准确可靠。本研究第1次将GRA1抗原作为急性弓形虫感染的诊断指标，建立相应的检测方法，成功地在人工感染样品中检测到弓形虫急性感染，可为弓形虫急性感染的诊断提供参考，对临床上急性弓形虫病的治疗有指导意义。 相似文献
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为了建立一种简单、快速、灵敏、特异的肉鸡组织中氟喹诺酮类抗生素残留检测方法,试验采用胶体金标记单克隆抗体与竞争抑制方法,组装了检测氟喹诺酮类抗生素残留的胶体金免疫层析试纸条。结果表明:将具有氟喹诺酮类药物母核结构共性特征的环丙沙星(CPFX)与牛血清白蛋白(BSA)偶联,获得了人工抗原CPFX-BSA,免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,筛选得到了3株抗氟喹诺酮类抗生素广谱特异性单克隆抗体,分别命名为2D5、3E9、4H8。以4H8单克隆抗体对10种氟喹诺酮类抗生素的广谱性最好、敏感性最强,将4H8单克隆抗体纯化后标记胶体金颗粒作为金标垫,分别以CPFX-BSA偶联蛋白和兔抗鼠IgG作为检测限和质控限,组装了检测氟喹诺酮类抗生素残留的胶体金免疫层析试纸条,该试纸条肉眼于10 min内即可判定结果。检测10种氟喹诺酮类抗生素均为阳性,而检测4种常见药物均为阴性。对CPFX、培氟沙星、达氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星的检测限为3.2 ng/mL,对沙拉沙星、双氟沙星、麻保沙星的检测限为6.4 ng/mL。在37℃条件下可稳定保存60 d,在4℃条件下可稳定保存360 d。检测2015—2016年河北省及周边地区的鸡肉样品3 414份,阳性率为0.76%,其中屠宰场、超市、活禽市场的阳性率分别为0.38%、0.10%、2.31%。说明胶体金检测氟喹诺酮类抗生素残留具有良好的广谱性、特异性、灵敏度、稳定性,且操作简单、检测快速,适合现场检测。 相似文献
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旨在探讨ZP3基因在海兰褐蛋鸡中的表达特性，为后期研究ZP3基因在蛋鸡卵泡发育中的作用提供理论支撑。本研究以产蛋期50周龄（50 W）海兰褐蛋鸡为试验对象，利用RACE技术克隆ZP3基因全长，并对编码区进行生物信息学分析。选择健康、体重相近的海兰褐蛋鸡6只，分别取心、肝、肺、肾、卵巢、胸肌、腿肌和不同等级卵泡构建表达谱。卵巢颗粒细胞经不同浓度（PBS、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1）促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）处理后，提取总RNA，采用实时荧光定量检测ZP3基因在各个样品的表达水平。结果表明，鸡ZP3基因全长1 415 bp，其中编码区1 341 bp，共编码446个氨基酸，位于10号染色体上，包含9个外显子；其亲缘关系与猪最远；跨膜结构预测表示，其含有一个跨膜结构域和一个信号肽区域；对其亲疏水性进行分析，预测该蛋白为弱的疏水性蛋白，蛋白质结构主要由无规则卷曲构成。组织表达谱显示，ZP3基因在鸡的卵巢中相对表达量最高。各等级卵泡ZP3表达分析显示，随着卵泡发育，ZP3基因在成熟卵泡（F1）颗粒细胞层表达量最高；在使用FSH处理等级颗粒细胞后，发现ZP3表达量显著上调（P<0.05），暗示ZP3基因在颗粒细胞中受到FSH激素调节。本试验对ZP3基因的结构进行了分析并预测该基因存在跨膜结构和信号肽区域。基因表达谱分析结果显示，ZP3基因在卵泡发育过程中表达量逐渐升高且主要在颗粒细胞中表达，可能受到FSH的调节作用，因此预测，ZP3基因可能与海兰褐蛋鸡繁殖功能相关。 相似文献
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建立了一种同时测定鸡肝中五种氟喹诺酮类药物残留的超高效液相色谱法(UPLC)。样品经磷酸盐缓冲溶液提取、C18柱净化,采用ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1mm,1.7μm)分离,以乙腈溶液和0.1%甲酸的水溶液作为流动相进行等度洗脱,荧光检测器检测。五种药物在0.005~0.5μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r均大于0.999;以0.05、0.15、0.30μg/g三个浓度水平进行添加回收试验,平均回收率为70.2%~98.2%,相对标准偏差为4.6%~12.1%,方法的检出限(LOD)为0.02μg/g,定量限(LOQ)为0.05μg/g。本方法重现性好、灵敏度高、简单、快捷,适用于鸡肝中五种氟喹诺酮类药物多残留的检测。 相似文献
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本文旨在分析旋毛虫二肽基肽酶1（dipeptidyl-peptidase 1，Dpp1）在体外对大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）增殖、迁移、凋亡以及一氧化氮（NO）分泌和吞噬功能的影响。根据GenBank中旋毛虫Dpp1基因序列设计一对特异性引物，RT-PCR获得该基因，将其亚克隆到pET-32a原核表达载体，IPTG诱导后获得重组蛋白rDpp1。将大鼠PBMCs与rDpp1共孵育，用间接免疫荧光试验（IFA）分析rDpp1与大鼠PBMCs的结合情况，分析不同质量浓度（10、20、40 μg·mL-1）的rDpp1对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。结果表明，40 μg·mL-1rDpp1极显著促进PBMCs增殖；10 μg·mL-1rDpp1能显著促进PBMCs迁移，而20及40 μg·mL-1时表现极显著的促进；20与40 μg·mL-1rDpp1极显著促进PBMCs分泌NO；10 μg·mL-1rDpp1能显著促进PBMCs的吞噬功能，而20及40 μg·mL-1时表现极显著的促进；各质量浓度蛋白均极显著地促进PBMCs的凋亡。旋毛虫二肽基肽酶1在体外能通过多种途径影响大鼠外周血单个核细胞，对调节宿主免疫应答有一定的促进作用。 相似文献
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通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法将诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星和沙拉沙星分别与牛血清白蛋白偶联制备免疫抗原,与卵清白蛋白偶联制备检测抗原,筛选一种可用于多种氟喹诺酮残留的检测抗体。将免疫抗原分别免疫獭兔制备多克隆抗体,采用间接竞争ELISA法测定抗体特异性。诺氟沙星抗体特异性较强,与同类药物的交叉反应较少,沙拉沙星抗体与同类药物发生交叉反应最多,且与诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的交叉反应率较高。结果表明,确定沙拉沙星抗体作为进一步研究的抗体。 相似文献
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为了探究添加亚油酸条件下不同剂量硝酸钠对水牛瘤胃体外发酵脂肪酸组成及相关微生物数量的影响,本试验选用3头装有永久性瘤胃瘘管的母水牛,以精粗比40∶60为底物进行瘤胃液体外发酵试验。试验组硝酸钠的浓度分别为1、2、3 mg·mL-1,对照组不加硝酸钠,每组均添加0.25 mg·mL-1的亚油酸,每组各5个重复。在体外培养3、6、9、12、24 h时测定产气量和甲烷产量,24 h结束培养,测定瘤胃体外发酵参数、脂肪酸含量及瘤胃微生物数量。结果表明：1）添加硝酸钠显著降低了总产气量和甲烷产量（P<0.05）;2）添加硝酸钠pH值和氨态氮（NH3-N）含量显著升高（P<0.05）,异丁酸和异戊酸含量显著降低（P<0.05）,而对总挥发性脂肪酸（TVFA）含量无显著性影响（P>0.05）;3）添加1 mg·mL-1硝酸钠,C18：2cis-9,trans-11、C18：2trans-10,cis-12含量和不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸（UFA/SFA）显著高于其他组（P<0.05）,且C20：5n3 （EPA）含量显著高于添加3 mg·mL-1硝酸钠组（P<0.05）,添加2 mg·mL-1硝酸钠C22：6n3 （DHA）含量显著高于其他组（P<0.05）;4）添加硝酸钠组原虫数量显著低于对照组（P<0.05）,添加2、3 mg·mL-1硝酸钠产甲烷菌数量显著低于添加1 mg·mL-1硝酸钠组（P<0.05）,添加1 mg·mL-1硝酸钠总细菌、真菌、溶纤维丁酸弧菌、蛋白分解丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌、亨氏丁酸弧菌数量显著高于其他组（P<0.05）。由此可得,体外法添加1~3 mg·mL-1硝酸钠和0.25 mg·mL-1亚油酸在维持水牛TVFA含量不变的情况下显著降低了甲烷含量,且1 mg·mL-1硝酸钠能促进亚油酸生成共轭亚油酸（CLA）,优化脂肪酸组成,并能增加大多数瘤胃微生物的数量。 相似文献
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LI Yi WANG Xianmei YANG Xu DENG Junhua WANG Fei LIU Qun XU Jianhai LIU Jing 《畜牧兽医学报》1956,51(12):3101-3110
The zoonotic protozoa Toxoplasma gondii is an opportunistic pathogen and distributes worldwide. Acute Toxoplasma infection causes serious pathological damages. Dense granule protein 1(GRA1) secreted by dense granule is an important component of Circulating antigen, which is an indication of acute toxoplasmosis. We aimed to use a monoclonal antibody against TgGRA1 to establish an enzyme-linked immunosorbent assay that targets antigen GRA1 in serum for acute toxoplasmosis diagnosis. First, the spleens of TgGRA1-His immunized mice were fused with SP2/0 cells,then we screened hybridomas that can constantly secret monoclonal antibody to the supernatant and injected them into mice to produce a large amount of mAbs. After the identification and purification of ascites, we choose one mAb as a capture antibody, HRP conjugated mouse anti-TgGRA1 polyclonal antibody as a detection antibody to develop sandwich ELISA. This method was used to detect samples from swine and mice artificially infected with Toxoplasma gondii. Besides, the results were compared with that of nPCR and two commercial kits to evaluate the efficiency of sandwich ELISA. We successfully got 4 mAbs with ascitic titers of 106-107, their subtypes are IgG1. Indirect fluorescent assay and Western blot showed that all of them can react specifically with TgGRA1.1G2 mAb and HRP conjugated mouse anti-TgGRA1 polyclonal antibody were used subsequently to establish sandwich ELISA for diagnosing acute infection. After optimization, sandwich ELISA can specifically detect 1.563 ng·mL-1 GRA1 or 100 ng·mL-1 ESA in serum. When detecting experimental animal samples, the sandwich ELISA exhibited the high consistency with the results of nPCR and showed higher efficiency than the commercial kits. In summary, we established a sandwich ELISA for acute toxoplasmosis diagnosis that captures one certain toxoplasma antigen GRA1, samples of artificially infected animals can be detected by this method, which makes acute toxoplasmosis diagnosis more reliable. It has guiding significance for clinical treatment of acute toxoplasmosis. 相似文献
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姜黄素固体分散体在猪体内的比较药动学研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究首次建立了测定猪血浆中姜黄素的高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS），比较了在内服给药途径下，姜黄素固体分散体和姜黄素预混剂在仔猪体内的药动学特征。选用16头7周龄左右健康二元杂交猪（约克夏×长白），公母各半，随机分为2组，每组8头，按100 mg·kg-1（以姜黄素计）分别灌服姜黄素固体分散剂和姜黄素预混剂，不同时间点采集血浆样品，经提取、净化后采用HPLC-MS/MS测定血浆中姜黄素的药物浓度，使用WinNonlin 5.2.1软件非房室模型计算、分析姜黄素在猪体内的药动学参数。结果显示，仔猪灌服姜黄素固体分散体和姜黄素预混剂后的药时曲线下面积（AUC）分别为（104.53±38.67）和（37.82±11.48）h·ng·mL-1；达峰时间（Tmax）分别为（3.25±0.38）和（2.31±0.37）h；峰浓度（Cmax）分别为（26.65±9.65）和（9.55±2.75）ng·mL-1；消除半衰期（t1/2β）分别为（3.55±2.17）和（6.93±0.86）h；平均驻留时间（MRT）分别为（5.23±0.53）和（4.26±0.47）h，统计分析表明，与预混剂相比，仔猪灌服姜黄素固体分散体后，主要药动学参数差异显著（P<0.01），Tmax明显延迟，Cmax显著提高，AUC明显增大，姜黄素固体分散体的相对生物利用度为280.39%。结果表明，姜黄素固体分散体可改善姜黄素在肠道的吸收，提高姜黄素的生物利用度，为今后姜黄素固体分散体的开发和临床应用提供科学依据。 相似文献
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A method for the detection of curcumin in pig plasma by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was established firstly and the pharmacokinetics of curcumin solid dispersion and curcumin premix in piglets were studied. Sixteen healthy piglets (Yorkshire×Changbai), seven-week aged, half male and half female, were randomly divided into two groups receiving curcumin solid dispersant and curcumin premix orally at the dose of 100 mg·kg-1, respectively. Then plasma samples were collected at different time points, and the blood concentration of curcumin was determined by HPLC-MS/MS. The WinNonlin 5.2.1 software was used to analyze and calculate the pharmacokinetic parameters. The pharmacokinetic parameters of curcumin solid dispersion and curcumin premix were as follows: the area under the curve (AUC) was (104.53±38.67) and (37.82±11.48) h·ng·mL-1, time to peak concentration (Tmax) was (3.25±0.38) and (2.31±0.37) h, peak concentration (Cmax) was (26.65±9.65) and (9.55±2.75) ng·mL-1, respectively, elimination half-life time (t1/2β) was (3.55±2.17) and (6.93±0.86) h, mean residence time (MRT) was (5.23±0.53) and (4.26±0.47) h. The statistical analysis showed significant differentce (P<0.01) between curcumin solid dispersion and premix in parameters, the Tmax of curcumin solid dispersion was delayed significantly, the Cmax was increased obviously and the AUC was improved after the piglets were given curcumin solid dispersion. Compared with curcumin premix, the relative bioavailability of curcumin solid dispersion was 280.39%. The results showed that curcumin solid dispersion could improve the dissolution and absorption of curcumin in the intestinal tract and improve the relative bioavailability of curcumin, which provided a scientific basis for the development and clinical application of curcumin solid dispersions in the future. 相似文献
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鸡胚外泌体miRNAs功能分析 总被引：2，自引：1，他引：1
旨在基于鸡胚外泌体及所含有的miRNAs解析其产生生理功效的活性物质基础及作用机制。本研究收集13胚龄惠阳胡须鸡胚蛋18枚（3组,每组6枚）,采用酶消化、蔗糖密度梯度和差速超速离心等方法分离鸡胚组织来源的外泌体,经透射电镜、纳米流式和标志蛋白流式检测等方法鉴定其特征。利用高通量测序方法研究外泌体样本中miRNAs表达谱,对各样本top 10且共表达的miRNAs进行靶基因预测与功能分析。结果表明,分别获得了3个浮力密度范围（S1：1.13 g·mL-1、S2：1.21 g·mL-1和S3：1.32 g·mL-1）具有外泌体典型特征的胞外囊泡;与miRBase V21进行比对发现,S1、S2和S3样品中分别含有675、661和845个已知的miRNAs,这些miRNAs中有488个（52.6%）三者共有,包括了广泛参与细胞增殖、分化和免疫应答等过程的功能性miRNAs。TargetScan 7.2和miRDB预测得到3个样本中top 10且共表达的56个miRNAs的靶基因,获得的3 650个靶基因经DAVID分析,显著富集了24个与机体生长、发育、免疫等有关的生物学通路（P<0.05）,包括MAPK信号通路、mTOR信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路和GnRH信号通路等。本研究建立了鸡胚组织中有效分离外泌体的方法,发现鸡胚组织来源的外泌体miRNAs会影响机体生长发育和免疫调节有关的生物学通路。 相似文献
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旨在对不同日龄雏鸡开展恩诺沙星可溶性粉混饮给药的药动学研究,并利用获得的药动学参数通过PK/PD模型结合Monte Carlo模拟（Monte Carlo simulation,MCS）评价恩诺沙星可溶性粉推荐给药方案的合理性。分别在1、7和14日龄雏鸡进行恩诺沙星可溶性粉75 mg·L-1（以恩诺沙星计）混饮给药,按预定时间点采集血样,采用经验证的HPLC法测定各时间点每只鸡的血药浓度,拟合药动学参数。将获得的药动学参数与美国临床和实验室标准协会（CLSI）给出的恩诺沙星对禽大肠杆菌的敏感性折点值（0.25 μg·mL-1）结合计算PK/PD参数,并通过MCS获得当前给药方案在大肠杆菌不同MIC分布下的达标率（target attainment rate,TAR）。结果显示,1、7和14日龄雏鸡3个处理组在第0天达峰浓度（Cmax）分别为0.561、0.564和0.550 μg·mL-1,24 h曲线下面积（AUC0-24）分别为8.85、9.85和9.27 μg·h·mL-1;3个处理组给药第4天Cmax分别为0.599、0.550和0.487 μg·mL-1,平均稳态血药浓度（Cavg）分别为0.513、0.493和0.432 μg·mL-1,AUC0-24分别为12.31、11.82和10.37 μg·h·mL-1,Cmax/MIC分别为2.40、2.20和1.95,Cavg/MIC分别为2.05、1.97和1.73,AUC0-24/MIC分别为49.24、47.28和41.48。恩诺沙星对MIC≤0.25 μg·mL-1的大肠杆菌临床分离株,1、7和14日龄雏鸡给药期间TAR为75.01%～76.11%。以上结果表明,恩诺沙星可溶性粉按目前的推荐给药方案对敏感菌PK/PD参数比值和TAR均达不到预期,不仅杀菌效果有限,且易诱导细菌产生耐药性。 相似文献