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根据GenBank上登录的绵羊抑制素α亚基基因序列,设计合成2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增获得了约812bp片段,经pMD18-T载体克隆和测序分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基前体基因。进一步通过PCR反应扩增新疆细毛羊INHα亚基基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆于pET32a原核表达载体,获得pET—INH重组表达载体。将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol·L^-1IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。 相似文献
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为获得区别结核感染状态的血清学鉴别诊断试剂的抗原,根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的ACR基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,PCR扩增得到ACR基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,得到载体pGM-T-ACR.分别将pET32a质粒和pGM-T-ACR质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,并将纯化的ACR基因亚克隆至pET32a中,获得重组表达质粒pET32a-ACR.将其转化E.coli BL21 IPTG诱导后,经SDS-PAGE、western blot分析鉴定,可见约34 ku的外源蛋白带.表明ACR基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的ACR融合蛋白. 相似文献
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旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×108 IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2-10.29,抗P... 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因. 相似文献
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猪戊型肝炎病毒结构蛋白片段的表达及其在ELISA中的初步应用 总被引：6，自引：0，他引：6
为建立一种快速的猪戊型肝炎病毒抗体检测方法，根据已克隆的戊型肝炎病毒株DQ1结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析，在其序列上设计一对引物，上游引物和下游引物分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，用PCR方法扩增，获得369bp大小的相应片段，位于ORF2128—497bp处。将扩增片段克隆到pET-32a构建了原核表达载体pET32a—D001，经测序证明该片段正确插入。将pET32a—D001转化BL21并诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达蛋白大小为33ku，Western-blot结果表明表达的蛋白质具有生物活性，将表达蛋白作为诊断抗原，对反应条件进行优化，初步建立了ELISA诊断方法。 相似文献
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采用PCR方法从鲁西黄牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a+中,构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α,进行测序和诱导表达.测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498 个核苷酸,含1个开放阅读框(ORF),编码166 个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%.表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%.表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后免疫昆明系小鼠2次,制备高滴度的牛IFN-α抗血清.结果从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-α C2,实现了高效表达和纯化,并制备了鼠抗牛IFN-α,为重组牛干扰素的开发奠定了基础. 相似文献
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根据GenBank上发表的羊痘病毒(CPV)P32基因序列,设计并合成一对引物,PCR扩增出837bp基因片段并克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定并测序。将P32基因定向克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用镍离子亲和树脂在变性条件下对蛋白进行纯化,Western blot证明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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猪Ghrelin基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达． 相似文献
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新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建 总被引：4，自引：3，他引：1
为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础. 相似文献
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根据GenBank中发表的结核杆菌H37RV的ESAT6基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,用PCR方法扩增得到EsAT6基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,成功构建克隆载体pGM-T-ESAT6.分别将pET28a-GFP质粒和pGM-T-ESAT6质粒用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,并将纯化的ESAT6基因亚克隆至pET28a-GFP中,构建原核表达载体pET28a-GFP-ESAT6.将pET28a-GFP-ESAT6转化E.coli BL 21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot分析,可见相对分子质量约37 200的外源蛋白带,表明GFP-ESAT6融合基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NT、A Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的GFP-ESAT6融合蛋白. 相似文献
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将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。 相似文献
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以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a（＋）中,得到重组质粒pET64-85.该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21（DE3）转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2＋螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应. 相似文献