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1.
本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus, PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL-1。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。 相似文献
2.
《中国兽医学报》2020,(8)
为掌握云南省虫媒病毒的流行情况及基因分型,本试验在云南省师宗、江城和芒市设立监控点,对哨兵动物定期采血来监测其血清转阳情况,将阳性样品在BHK上传代以分离病毒,用RT-PCR及MNT鉴定病毒,通过特异性引物扩增分离毒株的Segment2 (Seg-2)及Segment7(Seg-7)基因片段来分析其遗传特性。结果显示,在2014年从师宗监控点分离得到4株帕利亚姆病毒(PALV),经鉴定均为中山病毒(Chuzan virus,CHUV),并掌握了分离株Seg-2及Seg-7基因片段的遗传特征。本试验确认了CHUV在云南省的分离,为进一步掌握CHUV在中国的流行病学、致病性以及疫苗研究奠定良好基础。 相似文献
3.
为建立一种简便、快速的中山病血清抗体监测方法,本研究采用纯化的中山病病毒(CHUV)包被ELISA反应板,兔抗CHUV多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测CHUV抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为4.12μg/m L,竞争抗体最佳使用浓度为1∶12 000倍。特异性试验显示该C-ELISA方法仅能检测CHUV抗体,其它相关病毒阳性血清检测结果均为阴性。对已知阳性样品的检测结果表明,本研究建立的C-ELISA方法敏感性高于血清中和试验和琼脂扩散试验。分别用C-ELISA、RT-PCR和病毒分离试验对监控动物每周采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其它两种方法检测结果对应一致。本研究建立的C-ELISA为CHUV抗体的检测提供了一种快速、方便、可靠的方法。 相似文献
4.
《中国预防兽医学报》2016,(8)
为建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的DTMUV E基因保守区域设计引物和探针,建立了检测DTMUV的一步法RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法,并比较了两种方法的敏感性和特异性。结果显示,荧光定量RT-PCR标准曲线的相关系数(R~2)为0.999,DTMUV RNA在10~2拷贝/μL~10~7拷贝/μL范围内与Ct值呈现良好的线性关系;两种方法均仅对DTMUV RNA具有特异性扩增,而对其他常见鸭病原核酸的扩增均为阴性,具有较强的特异性;一步法RT-PCR对鸭胚纯培养病毒RNA的检测下限为10~3拷贝/μL,而荧光定量RT-PCR的检测下限为10~2拷贝/μL;重复性试验的变异系数均小于1.5%。对20份模拟临床样品的检测结果表明,一步法RT-PCR的阳性率为75%(15/20),而荧光定量RT-PCR的阳性率为90%(18/20)。本研究表明所建立的DTMUV荧光定量RT-PCR特异性强、重复性好、敏感性更高,更适用于DTMUV的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
5.
《动物医学进展》2021,42(9)
为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法,根据BVDV-1(AF091605.1、KF501393.1、MK204904.1、MN513404.1和MG923683.1)和BVDV-2(AF502399.1、MG436782.1、 AF145969.1、KC176777.1和MN513411.1)流行毒株5′-UTR保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,建立可同时检测BVDV-1和BVDV-2的双重RT-PCR方法。结果显示,该检测方法重复性好、特异性强,可分别检测出BVDV-1和BVDV-2核酸,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;最低检测量为1×10~3拷贝/μL和1×10~2拷贝/μL;对达州及周边地区的332份临床样品进行检测,结果表明,该地区BVDV-1阳性率为7.83%,BVDV-2阳性率为0.90%,未检出BVDV-1和BVDV-2混合感染的临床样品。综上所述,建立的双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,可用于BVDV的临床诊断和分子流行病学调查。 相似文献
6.
本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒（epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV）,2株血清型分别为4型和5型的蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）,1株帕利亚血清群病毒（palyam serogroup virus,PALV）中的D’Aguilar virus（DAV）血清型病毒和2株未鉴定出的环状病毒。经病毒Seg-2、Seg-3序列ORF区的比对和进化分析显示,7株病毒的地域型均为Eastern型,与日本、澳大利亚和印度毒株具有最近的亲缘关系。3头哨兵动物的血液和血清,经病毒核酸及血清中和试验检测,证明3头动物均被相应的病毒感染。动物感染病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,3~4周后达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量2~4周到达最高点后则呈迅速下降趋势。本研究报道了景洪虫媒病毒的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性,研究结果为进一步了解当地的牛虫媒病毒提供数据支撑,同时3头牛分离获得7株病毒,提示当地可能还存在更多种类的虫媒病毒。 相似文献
7.
为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛肠道病毒（BEV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCV）的方法,根据BVDV 5’UTR基因、BEV 5’UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。 相似文献
8.
《中国预防兽医学报》2015,(9)
猪Deltacoronavirus(PDCo V)是2014年在美国检测出的一种新型猪冠状病毒,能够引起感染猪出现水样腹泻、呕吐和脱水等症状。为及时评估该病毒在我国猪群中的感染和流行情况,本研究根据Gen Bank中登录的PDCo V核苷酸序列设计并合成一对特异性引物,在我国首次建立了PDCo V的RT-PCR检测方法。研究结果表明,所建立的RT-PCR检测方法仅对PDCo V核酸具有特异性扩增,对其它猪主要病毒核酸的扩增均呈阴性,具有较强的特异性;对PDCo V最低检测限为4.05×103拷贝/μL,敏感性较高;采用该方法对2014年~2015年我国华东地区猪场的526份临床样品进行检测,结果显示PDCo V总阳性率为4.75%(25/526),其中腹泻样品中阳性率为25.76%(17/66),表明我国猪群中存在PDCo V感染。本研究建立的RT-PCR方法可以作为临床检测PDCo V的一种有效手段。 相似文献
9.
牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244 bp和382 bp.该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL.应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒.结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断. 相似文献
10.
《中国预防兽医学报》2017,(2)
为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、水疱性口炎病毒(VSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV),猪瘟病毒(CSFV)以及猪伪狂犬病病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的参考病毒株序列,选择各病毒的保守序列设计5对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种可以同时快速检测以上5种病毒的多重RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对不同的细菌或病毒模板扩增结果均为阴性,特异性强;敏感性试验表明该方法对PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少检出量分别为8.82×10~3拷贝/μL、6.87×10~4拷贝/μL、5.71拷贝/μL、4.93×10~4拷贝/μL和4.32×10~2拷贝/μL。以上结果表明该方法快速、灵敏、特异性强,对以上5种猪病病毒能够进行快速鉴别检测,为其临床诊断与流行病学调查提供了有效的检测方法。 相似文献
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为了解牛感染帕利亚姆亚群达圭勒病毒（D’Aguilar virus,DAGV）情况,本研究应用BHK21细胞对2019年云南省景洪市采集的健康黄牛血液样品进行盲传病毒分离,对出现细胞病变的样品进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S2、S3、S7基因序列测定和比对分析。结果显示,有5个血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察到完整病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳结果发现5株新分离病毒基因组为10节段,呈现3-3-4的电泳带型特征,其带型特征与2014年在云南分离到的DAGV V106/YN/2014毒株相似;5株病毒S2、S3、S7基因核苷酸、氨基酸序列相似性均为100%,S3、S7片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的帕利亚姆亚群病毒（Palyamserogroup virus,PALV）毒株相似性最高;S2片段氨基酸与核苷酸序列与日本分离的DAGV相似性最高。S2、S3、S7基因遗传进化分析结果显示,5株新分离毒株间基因相似度为100%;5个毒株的S7与S3基因序列均与中国本土分离的已知部分PALV毒株在同一分支,亲缘关系较近,提示这5株毒株为PALV;5株毒株S2片段核苷酸序列与日本分离的部分DAGV毒株位于同一分支上,亲缘关系较近,进一步证实这5株毒株为PALV DAGV。本研究成功分离到5株DAGV毒株,并进行了基因片段遗传进化分析,为进一步开展DAGV流行病学研究提供基础。 相似文献
12.
赤羽病病毒套式RT-PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中已发表的赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了3条特异性引物,建立了检测AKAV的套式RT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增出AKAV的S基因片段,但从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)等13种对照病毒中均不能扩增出目的条带。敏感性试验表明,套式RT-PCR能够扩增10-5稀释度的病毒RNA(核酸含量约1.18 ng/μL),比普通RT-PCR高出1 000倍。用此方法检测130份奶牛血清样品与1份流产胎儿病料,均未检测到阳性样本,但AKAV在血清模拟样品中可被有效检出。研究结果表明,该方法灵敏、特异,为AKAV的检测提供了一个快速、有效的手段。 相似文献
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鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
16.
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）变异野毒JXA1的基因变异序列和疫苗株JXA1-R的基因遗传标志设计合成了2对特异性引物,结合快速RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立了JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒的快速鉴别体系,其目的片段大小分别为400、290 bp,该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒的PCR检测结果均为阴性;对JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒RNA的最低检测量分别为103、104拷贝/μL。该方法敏感、特异,适用于临床样品的检测。 相似文献
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【目的】 了解西南边境地区牛感染中山病病毒（Chuzan virus,CHUV）的情况。【方法】 应用BHK21细胞对云南景洪、江城采集的312份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,对出现细胞病变的毒株进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S7、S2基因序列测定和比对分析。【结果】 4份血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳发现,4株分离毒株基因组为10节段,带型为"3-3-4",与2012年云南师宗分离的CHUV SZ187毒株相似;4株病毒S7、S2基因核苷酸序列相似性分别为98.7%~99.7%和97.9%~99.1%;S2基因片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的SZ187、GHN-GS-16等毒株相似性最高;S7基因片段核苷酸和氨基酸序列与日本分离的ON-1/E/18、ON-3/E/17及中国本土的SZ187、GHN-GS-16等毒株的相似性最高。S7、S2基因遗传进化分析结果显示,4株新分离毒株亲缘关系最近;4株毒株的S7基因序列与中国本土和日本分离的已知帕利亚姆血清群病毒（Palyam serogroup virus,PALV）毒株位于同一分支,提示4株毒株为PALV,且形成一簇,有一定的地域性;4株毒株S2基因片段核苷酸序列与中国本土分离的CHUV位于同一分支,亲缘关系较近,进一步证实这4株毒株为CHUV。【结论】 本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到CHUV毒株,为CHUV在中国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。 相似文献
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为建立高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP/LP-PRRSV)快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的HP-PRRSV与LP-PRRSV的Nsp2基因序列,分别设计了特异性的上游引物(HP-Upper-p1/LP-Upper-p2) 和共用下游引物(Co-Lower-p3)。以HP-PRRSV和LP-PRRSV混合物总RNA为反转录模板,建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV的二重RT-PCR检测方法;并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测。结果显示,本试验成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,该方法灵敏度高,最低检出限均为100拷贝/μL;重复性好,特异性强,可特异性地扩增HP-PRRSV细胞培养物和LP-PRRSV疫苗毒,但对Marc-145细胞和其他8种病原对照扩增不出任何条带;自25份临床疑似PRRSV感染病料中共检测出了21份PRRSV阳性样品,其中HP-PRRSV阳性样品共计20份,LP-PRRSV阳性样品4份。结果表明,本研究成功建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR检测方法,可适用于高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征的快速鉴别诊断。 相似文献
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荧光定量RT-PCR法对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究犬人工感染犬瘟热病毒(CDV)后病毒在血清和粪便中的含量及变化,本实验根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列设计一对特异引物,扩增NP基因.并以NP基因重组质粒作为阳性标准品,建立检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法.结果表明,该方法102拷贝～109拷贝范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.998,扩增效率为E=98.3％,敏感度高,最低检测限为6.1拷贝/μL,重复性检测变异系数低于2.62％.该方法与常规RT-PCR方法比较,其敏感性提高102倍.两只人工感染CDV PS强毒株的犬,分别于接种后17d、19d发病死亡,采用荧光定量RT-PCR方法对人工感染犬的血液和拭子液中的病毒核酸栽量进行定量检测以及对收集的22份临床样本拭子液进行检测,均检测到CDV.本研究结果表明,该方法可以用于CDV核酸定量检测,为该病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供了一种快速和敏感的检测手段. 相似文献