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1.
根据GenBank上蓝舌病病毒(BTV)、O型口蹄疫病毒(FMDV)、山羊痘病毒(GPV)、绵羊痘病毒(SPPV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等5种病毒的特异性保守序列,分别设计多重荧光标记引物和相应寡核苷酸探针.使用芯片点样液稀释各探针至终浓度30μmol/L,点样制备11×11阵列芯片.核酸杂交后,建立并优化基因芯片检测方法.结果显示,使用470 mL/L甲酰胺杂交液,42℃摇转杂交4h为最佳基因芯片杂交条件.建立的基因芯片检测方法与伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)等无交叉反应,检测敏感性可达20拷贝病毒核酸.制备的基因芯片稳定,保存6个月可用.对151份临床样品进行基因芯片和商业化PCR试剂盒平行检测,两者的符合率为100％. 相似文献
2.
对伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和流行性乙型脑炎病毒（JEV）检测基因芯片的制备及该芯片的检测技术进行了研究。选定靶基因最佳点样质量浓度为200 mg/L,用基因芯片点样仪将其点制在氨基化基片上,经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后,成功制备了PRV-PPV-JEV检测基因芯片。以CY3荧光素标记的dCTP经PCR扩增制备探针,对芯片的质量进行了评价。结果表明,制备的芯片质量好,探针最佳使用质量浓度为3 000μg/L,芯片系统检测灵敏度可达3μg/L。该芯片可同时检测PRV、PPV和JEV,其灵敏度高、特异性强,芯片可重复使用,室温下至少可保存4个月。 相似文献
3.
区分禽流感病毒亚型诊断基因芯片的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
制备了可同时区分AIVH5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因诊断芯片。试验以重组质粒为模板,进行PCR扩增,然后用异丙醇沉淀法进行纯化,制备探针及内参基因。将探针及内参基因用点样缓冲液稀释到0.3μg/μL后用芯片点样仪将其点制到醛基化基片上,样点中心间距450μm,样点直径220μm。将点好的基片在室温干燥24h以上,后经65℃再水合10s、80℃干燥、65mj紫外线交联照射25min后,再用封闭液封闭,95℃变性处理,成功构建了能区分禽流感血凝素H5,H7,H9亚型及神经氨酸酶N1,N2亚型的检测基因芯片。在PCR扩增中标记待检样品,对制备的检测芯片进行质量检验,结果表明,制备的区分禽流感病毒亚型基因芯片可区分AIV部分亚型。 相似文献
4.
猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的构建 总被引：6，自引：0，他引：6
采用PCR扩增制备TGEV的靶基因并进行纯化,对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选,选择构建检测芯片的最适靶基因,进行基因芯片探针最佳标记方法试验.结果表明,质粒PCR扩增和采用异丙醇沉淀纯化的靶基因质量好,基因芯片最佳靶基因点样质量浓度为200mg/L,最佳探针质量浓度为3 000 μg/L,预杂交时间为1 h,杂交时间为3～6 h,杂交温度为48℃,以S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7个靶基因为构建TGEV检测芯片的最适靶基因,确定了多重PCR扩增标记TGEV探钟的最佳体系,Cy3-dCTP标记浓度为2.5 μmol/L,构建的TGEV检测芯片与标记的混合探针杂交效果好. 相似文献
5.
为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。 相似文献
6.
为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。 相似文献
7.
为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为102拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为104拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。 相似文献
8.
本研究以猪细小病毒VP2基因为目的基因设计引物和探针,通过不对称PCR扩增Cy3标记的DNA片段与固定于芯片上的探针进行杂交,对杂交芯片进行扫描分析,根据荧光信号的强度来确定是否存在猪细小病毒。结果表明,采用浓度为5μmol/L的探针与PCR产物于47℃杂交1 h即可得到清晰的荧光信号,检测灵敏度可达34.5 ng/μL,同时用制备的基因芯片对临床20份疑似猪细小病毒病感染的病料进行检测,检测结果与PCR检测结果符合率达100%,表明基因芯片检侧技术是一种灵敏度高、特异好的检侧方法。该方法的建立可以快速有效地对猪细小病毒做出诊断,具有较好的应用前景。 相似文献
9.
猪伪狂犬病、猪细小病毒病和猪流行性乙型脑炎检测基因芯片的制备及检测方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
对猪伪狂犬病(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒病(Porcine parvovirus,PPV)和猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)检测基因芯片的制备及该芯片的检测方法进行了研究。试验克隆和鉴定了16个芯片靶基因,经筛选,取其中13个靶基因PRV gB、gG、TK和gE;PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5制备PRV、PPV和JEV检测基因芯片,基因芯片点样系统SpotArrayTM 24将靶基因点样于氨基化玻片表面,靶基因最佳点样浓度为200 ng/μL,探针扩增标记反应体系中,Cy3-dCTP使用终浓度为2.5μmol/L,芯片杂交温度可在44℃～60℃之间任意选择。以PRRSV、CSFV、PCV1、PCV2、TGEV、HPS、PAP、E.coli和S.pp菌毒株DNA或CDNA为模板标记制备的探针均不与PRV、PPV、和JEV检测基因芯片杂交,芯片检测的灵敏度为3 pg/μL,芯片批间重复性好,同一张芯片可进行至少10次的重复杂交。该方法对8株PRV、5株PPV和JEV SA14-14-2单独或混合样品检测均为阳性,可区分伪狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品单独或混合感染的检出率分别为:单独感染PRV检出率15%(3/20),PPV 5%(1/20),JEV 0%(0/20);PRV和PPV混合感染检出率15%(3/20),PRV和JEV混合感染检出率5%(1/20),JEV和PPV混合感染检出率5%(1/20),三者混合感染的检出率5%(1/20)。与PRV、PPV和JEV多重PCR检测方法比较,芯片检测的灵敏度大大提高,同时可区分PRV野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品的检出率一致。 相似文献
10.
基因芯片方法检测6种动物源性人兽共患病病原 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立可同时检测H5亚型禽流感病毒、狂犬病病毒、猪链球菌2型、炭疽芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的基因芯片检测方法,本实验根据GenBank中上述6种病原的基因序列,设计并合成了特异性的引物和探针.采用点样法制备杂交芯片,将上述病原扩增产物混合后与芯片杂交.杂交结果显示,针对本试验中6种人兽共患传染病所设计的寡核苷酸探针可特异性识别靶基因,与其他常见病原体之间没有交叉反应.检测的灵敏度在1.38×10-5pg/μL～151 pg/μL之间.将建立的基因芯片检测方法对临床样品进行检测,结果与荧光PCR方法一致. 相似文献