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1.
《畜牧与兽医》2020,(10)
为研究融合表达肿瘤靶向肽(RGD)、细胞穿膜肽(TAT)和白树毒素(GEL)基因重组减毒沙门菌对乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外抑制作用,将重组质粒载体pEGFP-RGD-TAT-GEL导入至减毒沙门菌LH430中,构建了重组减毒沙门菌LH430-RGD-TAT-GEL。经PCR、双酶切鉴定正确后,将重组菌转染MDA-MB-231细胞,提取总RNA后进行反转录,采用PCR技术检测目的基因的转录情况,细胞增殖毒性试验检测重组菌对MDA-MB-231细胞和HEK-293细胞的抑制率。结果显示:被重组菌转染后的MDA-MB-231细胞经RT-PCR检测,目的基因高效表达,对MDA-MB-231细胞最佳抑制条件为细菌浓度1×10~8 CFU/μL,转染时间为48 h,且半数抑制浓度为4.643×10~7CFU/μL。本试验为研究细胞穿膜肽、核糖体失活蛋白和细菌联合治疗肿瘤的后续动物试验提供试验支持。 相似文献
2.
本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
3.
《中国畜牧兽医》2019,(11)
本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd~+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493)构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430(pYA-gfp),对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493),能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
4.
本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株.PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5.将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5).鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测.结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体.本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础. 相似文献
5.
《中国畜牧杂志》2019,(4)
为研究核受体RORα对小鼠睾丸间质细胞凋亡的作用,实验使用褪黑素(MT)、核受体RORα拮抗剂SR1001、MT+SR1001、无血清培养液处理小鼠睾丸间质细胞36 h,检测细胞活力、细胞凋亡率以及凋亡相关基因Bcl2、Bax mRNA表达量。结果表明:与对照组相比,褪黑素可极显著降低细胞凋亡率、提高细胞活力及抗凋亡基因Bcl2 mRNA表达量(P<0.01),抑制促凋亡基因Bax mRNA表达量(P<0.05);与MT组相比,MT+SR1001处理后细胞活力(P<0.05)及Bcl2表达量(P<0.01)降低,细胞凋亡率极显著上升(P<0.01),Bax表达量显著上升(P<0.05)。结果提示,褪黑素可通过RORα途径抑制小鼠睾丸间质细胞凋亡。 相似文献
6.
7.
《中国兽医学报》2016,(5):739-745
选择新城疫病毒(NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因作为黑色素瘤的治疗基因。将小鼠端粒酶逆转录酶(mTERT)启动子、小鼠黑色素瘤酪氨酸酶(Tyr)特异性启动子核心片段以及HN基因分别插入到腺病毒载体穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-2的多克隆位点处,将克隆成功的穿梭载体经Pme I线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,成功构建了肿瘤特异性和组织特异性双启动子调控的HN基因的重组腺病毒载体pAd-mTERTp-mTyrp-HN。将重组腺病毒通过脂质体法转染HEK 293细胞,经RT-PCR鉴定及Western-blotting对HN蛋白的表达水平分析后,大量扩增病毒,经CSCl密度梯度超速离心法纯化病毒颗粒,以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-TyrpHN和Ad-GFP的最终滴度分别为108.7、109.5、109.25、109.625和109.125,将为下一步利用该重组腺病毒在体内外诱导小鼠黑色素瘤细胞系B16的凋亡及研制动物肿瘤性疾病的基因疫苗提供了理论依据。 相似文献
8.
为探究牛坏死杆菌对小鼠乳腺上皮细胞系(EPH4细胞)增殖和凋亡的影响，本研究将坏死杆菌(牛A25菌株)以感染复数(MOI)为100感染EPH4细胞，用EdU细胞增殖法检测细胞增殖率，用Hoechst染色以及DNA Ladder检测细胞凋亡，并用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测凋亡基因的mRNA相对表达量变化。EdU检测结果显示，坏死杆菌可抑制EPH4细胞增殖；Hoechst染色以及DNA Ladder检测结果均显示，坏死杆菌可促进细胞凋亡的发生；RT-qPCR结果显示，与对照组相比，坏死杆菌感染EPH4细胞2 h时，促凋亡基因Bax、Bax/Bcl-2的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),感染4 h时，促凋亡基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.001),感染6 h时，促凋亡基因AIF的mRNA相对表达量极显著上调(P<0.001)。由此可见，牛坏死杆菌能够抑制EPH4细胞增殖且诱导细胞凋亡，为进一步研究坏死杆菌致病机制提供了相关数据支持。 相似文献
9.
表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定 总被引：5，自引：1，他引：4
应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中，重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色；在体内稳定试验中，经ICR小鼠连续传代10次，从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色，证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示，鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD，这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后，观察1个月未见有异常现象，同时剖栓后也未见脏吕有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型，为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理的提供了一个有力的工具，同时在相关疾病的免疫防制基础研究中亦有重要应用价值。 相似文献
10.
将PCR扩增获得的弓形虫SAGI基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建成pcDNA3-SAG1真核表达质粒,高压电转化入dam和PAOP基因双突变的减毒沙门氏菌(ZJ111株)中,并直接转染Vcro细胞,胰酶消化、收集细胞,SDS-PAGE和western blot可检测到30 ku左右的蛋白条带和印迹带.结果表明减毒沙门氏菌能将外源基因呈递给Vero细胞并进行表达. 相似文献
11.
为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。 相似文献
12.
为探讨双启动子调控HN基因重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN对小鼠黑色素瘤动物模型的抑瘤作用,试验构建B16裸鼠皮下移植瘤模型,采用HEK293细胞扩增重组腺病毒,进行纯化和滴度检测。将重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN、Ad-GFP和PBS通过尾静脉注射裸鼠,冰冻切片观察裸鼠肿瘤内GFP绿色荧光表达情况,通过肿瘤生长和裸鼠存活情况计算抑瘤率,探究其在体内的抗肿瘤作用。结果显示:重组腺病毒在HEK293细胞中扩增,滴度分别为10^11.250,10^12.250,10^10.625,10^12.125,10^12.250 TCID50/mL;肿瘤组织中能观察到黑色素细胞,证明皮下黑色素移植瘤模型构建成功;重组腺病毒对脏器无损伤,且在双启动子组脏器中没有观察到黑色素细胞的肝肺转移;通过尾静脉注射重组腺病毒后能够在肿瘤中观察到荧光表达;与其他组相比双启动子组重组腺病毒不但能抑制黑色素瘤的生长,而且能延长裸鼠的生存期,抑瘤率为55.5%。因此,该重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN具有靶向性,并且可以抑制肿瘤生长,可为黑色素瘤的治疗提供参考。 相似文献
13.
为研究饲粮蛋白水平日变化对育肥猪生长性能和血液生化指标的影响,试验采用单因子试验设计,选择180头健康状况良好、平均体重为(35.31±0.96)kg的“杜×长×大”三元杂交商品猪,随机分为3个处理组,每组设6个重复,每个重复10头猪。对照组全天饲喂基础饲粮,试验1组早上饲喂低蛋白水平饲粮、晚上饲喂高蛋白水平饲粮,试验2组早上饲喂高蛋白水平饲粮、晚上饲喂低蛋白水平饲粮,试验期30d。结果表明:(1)与对照组相比,试验1组平均日增重降低5.71%(P>0.05),试验2组平均日增重提高1.43%(P>0.05)。与试验1组相比,试验2组平均日增重显著提高7.58%(P<0.05)。(2)与对照组相比,试验1组的血磷、血钙、尿素氮、总胆固醇、甘油三酯浓度及乳酸脱氢酶活性均有降低趋势(P>0.05),葡萄糖浓度和总蛋白含量均有提高趋势(P>0.05),白蛋白含量显著提高17.86%(P<0.05)。(3)与对照组相比,试验2组的葡萄糖、血磷、甘油三酯浓度、总蛋白含量及乳酸脱氢酶活性均有降低趋势(P>0.05),白蛋白含量、血钙、尿素氮和总胆固醇浓度均有提高趋势(P>0.05)。综上,早上饲喂高蛋白水平饲粮、晚上饲喂低蛋白水平饲粮可提高育肥猪的生长性能,并可对机体蛋白质代谢产生积极作用。 相似文献
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主养凡纳滨对虾池塘水体理化因子及浮游生物变化特征 总被引：1，自引：0，他引：1
选取3个主养凡纳滨对虾的鱼虾混养池塘,在养殖季节(5—10月)每月对池塘水体理化性质和浮游生物进行监测。通过定期监测,研究了该类型池塘水体理化性质和浮游生物的时空变化特点。结果表明:在整个养殖过程中,p H随养殖时间延长略有上升,但是变化较小;化学需氧量和亚硝态氮呈上升趋势;总氮、总磷、锌离子、总碱度浓度呈先下降后上升趋势;氨氮浓度在养殖前期最高,随养殖时间延长逐渐下降,养殖后期趋于稳定;硝态氮浓度呈波浪形变化,但整个养殖过程浓度都比较低;活性磷浓度呈下降趋势;铜离子和悬浮物浓度呈先下降后上升再下降的趋势;盐度总体趋势平稳;总硬度呈先上升后下降趋势。养殖过程中共检测到7门38种藻类,养殖池塘浮游植物主要以绿藻门和蓝藻门为主;共检测到5类18种浮游动物,浮游动物组成主要以轮虫类和枝角类为主。综合浮游植物和浮游动物的调查结果,由Shannon-Wiener指数分级评分标准可知养殖前期的水质较差,浮游生物丰富度较低。 相似文献
16.
本研究应用女贞子多糖给小鼠饮水,探讨其对四氯化碳诱导肝损伤的保护作用。试验分为对照组、模型组、女贞子多糖高、中、低剂量组和阳性药组,通过检测各组小鼠的生长性能、肝脏指数、血清生化指标和丙二醛(MDA)的表达量,综合评估女贞子多糖的保肝作用。结果表明:与模型组相比较,饮水中添加不同剂量的女贞子多糖对小鼠生长性能无影响(P>0.05),但可以显著缓解四氯化碳所致的肝脏指数(P<0.05)、肝功能指标(P<0.05)和肝脏血清MDA含量(P<0.05)。饮水中添加女贞子多糖可以有效缓解小鼠化学性肝损伤,这可能与调节肝脏MDA的表达,抑制脂质过氧化反应有关。 相似文献
17.
VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的保护性抗原。原核表达中能否获得具有天然构象的可溶性VP2蛋白是研发IBD亚单位疫苗的关键问题。为了解是否存在鸡自体促溶标签蛋白以及外源促溶标签能否在一定程度上促进蛋白的正确折叠,试验对不同物种来源的类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)进行比对研究。结果显示,获取到的3种鸡源SUMO蛋白与酵母源SUMO蛋白的氨基酸同源性均高于40%,其中SUMO-1与SUMO-3两种蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达;通过SUMO-1、SUMO-3与VP2蛋白的融合表达,证明了鸡源SUMO蛋白对VP2具有促溶效果,得到的重组菌株P-28A-s1-VP2和P-28A-Os3-VP2琼脂扩散效价均达到1∶16;经过纯化后,融合蛋白SUMO-1-VP2的琼脂扩散效价可达到1∶256;使用SUMO蛋白酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果表明鸡源SUMO蛋白可以被成功切割,说明试验发现的鸡源SUMO蛋白可以作为促溶标签,在亚单位疫苗关键抗原表达中具有广阔的应用前景。 相似文献
18.
试验旨在研究发酵饲料对仔鸡十二指肠、空肠、回肠和盲肠中微生物菌群结构和多样性的影响,分析发酵饲料对仔鸡生长和健康的作用机理。选取1日龄海兰褐蛋仔鸡360只,随机分为3个处理组,每组6个重复,三组分别饲喂基础日粮、基础日粮+抗生素、基础日粮+发酵饲料,饲养56d,采用Illumina MiSeq测序技术测定各组蛋仔鸡肠道微生物群落结构和分布。结果显示:Chao1指数和Shannon指数表明,非发酵饲料组中微生物丰度和多样性均显著高于发酵饲料组,各组十二指肠、空肠、回肠的菌群丰度和多样性均显著高于盲肠;饲喂发酵饲料能显著增加乳杆菌丰度,同时降低肠道中脱硫弧菌属、螺杆菌等致病菌的数目,也间接证明乳杆菌可以抑制脱硫弧菌增殖,预防肠道疾病;饲喂发酵饲料能增加厚壁菌门丰度,显著降低拟杆菌门/厚壁菌门的比例,促进仔鸡的生长。 相似文献
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为探讨饲粮中添加不同水平的卤虫幼虫冻干粉对黄颡鱼生产性能及抗氧化能力指标的影响,采用单因素设计试验,将1200尾体质量为8.0 g黄颡鱼随机分为4组,每个组3个重复,每个重复100尾,1组为空白对照组饲喂基础饵料,2、3、4组为试验组在基础饵料中分别添加卤虫幼虫冻干粉100、150、200 mg/kg,试验期为42 d,试验结束测定黄颡鱼生产性能和血清中抗氧化能力指标。结果表明:(1)试验3、4组的增重率和特定生长率较1组分别提高9.46%、8.73%、8.11%、7.43%(P < 0.05),试验2、3、4组存活率均高于1组(P > 0.05);试验3、4组的饵料系数较1组分别降低16.45%、14.29%(P < 0.05);(2)试验3、4组血清中总抗氧化能力(T-AOC)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性较1组分别提高23.65%、20.95%、11.26%、11.05%(P < 0.05),试验2、3、4组血清中过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力均高于1组(P > 0.05);试验3、4组血清中丙二醛(MDA)的含量较1组分别降低23.76%、21.29%(P < 0.05)。综上,在饲料中添加150 mg/kg卤虫幼虫冻干粉可提高黄颡鱼生产性能和抗氧化能力。 相似文献
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旨在进一步阐明GnIH和VIP基因在绵羊季节性发情和繁殖调控中的作用。本研究选取短光照(模拟繁殖季节)和长光照(模拟休情期)下成年苏尼特母羊各3只及卵泡期和黄体期的小尾寒羊母羊各3只,同时选取短光照第21天和长光照第3、15、21、42、49天共6个不同光照时间点的成年苏尼特母羊各3只,屠宰后采集其性腺轴组织(下丘脑、垂体、松果体、卵巢、输卵管、子宫体),利用qPCR技术分析GnIH和VIP基因mRNA表达规律。结果表明,GnIH和VIP基因在2个绵羊品种上述各组织中均表达,且在下丘脑中的表达量较高;苏尼特羊下丘脑中2个基因在长光照条件下的表达量均极显著高于短光照条件(P<0.01);在小尾寒羊下丘脑组织中,黄体期VIP基因的表达量显著高于卵泡期(P<0.05),黄体期GnIH基因的表达量稍高于卵泡期,但差异不显著(P>0.05)。由短光照转至长光照时,苏尼特羊下丘脑中GnIH和VIP基因表达上升,至长光照第3天时,2个基因表达均达到峰值,之后呈下降趋势。本研究揭示了GnIH和VIP基因在季节性发情和常年发情成年绵羊性腺轴各组织中的定量表达特征,不同光照条件和不同繁殖时期绵羊下丘脑中这2个基因的表达变化进一步提示了GnIH和VIP基因参与绵羊季节性发情调控和发情时期转换;在短光照转至长光照过程中,GnIH和VIP基因主要在长光照前3 d发挥关键作用。 相似文献