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1.
《中国兽医学报》2017,(7):1309-1315
为探讨猪肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的抗菌和抗病毒活性,需要从猪肺泡液和羊水中分离纯化SP-A。首先通过化学交联法将麦芽糖共价交联在Sepharose胶粒上,制成能够与SP-A结合的胶粒,即麦芽糖-Sepharose(MS)。采集肺泡灌洗液(BLAF)和羊水(AF),以11 000r/min转速离心40 min获得富含SP-A的沉淀;将沉淀溶解于含8mol/L尿素的缓冲液I中使SP-A变性,再以无尿素的缓冲液I透析使其复性。然后在含Ca2+的结合缓冲液中用MS吸附SP-A,用含EDTA的洗脱液洗脱,洗脱的SP-A过Sephadex G-75凝胶柱得到纯化的SP-A。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示:在相对分子质量为35 000和70 000处出现特异的SP-A蛋白带(或杂交带)。菌体凝集试验显示:SP-A具有凝集E.coli的作用,表明制备的SP-A具有生物活性。抑菌试验证实SP-A对致病性E.coli、肠沙门杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌的增殖均有不同程度的抑制作用,特别是对E.coli和肠沙门杆菌抑制作用更为明显。抗病毒检测结果显示:SP-A可明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在MARC-145细胞中的增殖,同时对猪细小病毒(PPV)在PK-15细胞中的增殖也有一定的抑制作用。结果表明:制备的猪SP-A在体外具有明显的抗菌和抗病毒活性,这为以后进一步研究猪SP-A的生物学特性及抗菌、抗病毒活性提供了必要的条件。 相似文献
2.
《中国动物传染病学报》2016,(5)
为表达鸡肺表面活性蛋白A(chicken palmonary surfactant protein A,c SP-A)基因,本研究扩增去除终止子的c SP-A,通过Nhe I和Apa I双酶切,连接进入真核表达载体pc DNA3.1/myc-His(-)A中,构建获得重组载体pc SP-A;同时,将c SP-A和gfp基因按Nhe I-Bam H I和Bam H I-Apa I分别连接至pc DNA3.1/myc-His(-)A载体中,构建获得融合表达载体pc SP-A-GFP。通过脂质体法将这两类真核载体瞬时转染293T细胞,48 h后用4%多聚甲醛固定细胞,利用c SP-A特异性鼠多抗进行间接免疫荧光,于倒置荧光显微镜下观察c SP-A表达和亚细胞定位情况,然后收获细胞进行Western blot检测。结果发现,c SP-A在细胞质中表达,pc SP-A和pc SP-A-GFP融合蛋白的相对分子量分别约为30 k Da和55 k Da。上述研究结果为进一步研究c SP-A的功能奠定了基础。 相似文献
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猪肺表面活性蛋白A（Porcine surfactant proteinA,SP-A）是猪肺泡表面活性蛋白中含量最多、最先被发现具有炎症免疫调节功能的表面活性蛋白。本研究利用比较基因组学方法,设计了6对引物进行PCR扩增,克隆测序后进行拼接,获得了长为4037bp猪SP-A基因的全序列（gi：DQ985806）。经生物信息学分析,此序列包含了猪SP-A基因启动子区,含有1个747bp的完整开放阅读框,编码248个氨基酸;预测猪SP-A蛋白理论分子量约为26．37ku,蛋白的等电点为5．20;在1～20位氨基酸可能是信号肽序列;在大约1～20、120～135、145～160位氨基酸存在疏水性区域;跨膜结构分析表明此蛋白所有氨基酸都位于膜表面;并且发现猪SP-A蛋白同人SP-A蛋白一样也含有保守的碳水化合物识别区、胶原样区域和茎区。本结果为进一步对SP-A与猪呼吸道疾病相关性的研究奠定了基础。 相似文献
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牛肺泡巨噬细胞微小RNA的克隆与鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
MicroRNA(miRNA)是一类长19～26个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,其异常表达将会导致生理的异常和疾病的产生.为了研究miRNAs在牛肺泡巨噬细胞抗菌机制中的作用,构建了牛肺泡巨噬细胞miRNA cDNA文库,从438个克隆中筛选出22个miRNAs,其中有19个miRNAs在牛的miRBase数据库中没有发现,但是有8个miRNAs与人和(或)鼠中的序列完全同源,因此,将它们命名为Bta-miR-141、Bta-miR-187、Bta-miR-191、Bta-miR-448、Bta-miR-589、Bta-miR-873、Bta-miR-463和Bta-miR-562;另外有11个miRNAs在所有miR-Base数据库中都没有发现,有待进一步研究.这些数据为研究miRNAs调控牛肺泡巨噬细胞抗菌机制奠定了基础. 相似文献
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肺表面活性物质相关蛋白A的研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
肺表面活性物质相关蛋白A（pulmonary surfactant-associated protein A,SP-A）是肺表面活性物质（pulmonary surfactant,PS）中含量最丰富的蛋白成分,主要分布于支气管表面和肺泡气液界面上,属C-型胶凝素家族的重要成员,在维持PS的正常生物学功能和调节局部免疫及炎症反应方面发挥重要作用。研究结果表明,SP-A质和量的改变与哺乳动物的肺部疾病密切相关,以SP-A作为肺疾病严重程度的指标已日益受到重视。此外,在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症（ALI/ARDS）的治疗方面,PS替代治疗虽已获得了一定成功,但是,因现有外源性PS制剂中缺乏SP-A,使其疗效大受限制。因此,运用分子生物学手段,研究SP-A的表达调控,大量获取SP-A,将成为PS制剂研发的一个主要方向。 相似文献
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猪SP-A基因荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
SP-A(surfactant protein-A)mRNA的表达对肺的发育、成熟均起关键作用,并且与肺部疾病的发生相关。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SP-A表达量的方法,根据猪SP-A基因的mRNA序列(EU622632)设计引物,从纯化模板、PCR程序设计等方面进行了优化,建立了基于SYBR Green I染料技术的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法。结果表明,所建立的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法检测猪SP-A基因具有特异性好、简便、可靠等特点,为猪SP-A基因定量分析奠定了基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医文摘》2015,(4)
24只昆明小鼠随机分为对照组(8只,一次性灌胃生理盐水0.25 ml/只)、染毒组(8只,一次性灌胃百草枯水溶液250 mg/kg)和治疗组(8只,染毒小鼠按250 mg/kg剂量给予虎耳草水煎液灌胃治疗),给药2次/d,连续8 d。各组均于第9 d处死,取左肺制作石蜡切片。HE染色观察病理表现,免疫组化方法检测肺中表面活性蛋白A(surfactant-associated protein,SP-A)的含量。HE染色光镜病理观察,染毒组较对照组肺组织损伤程度显著加重,治疗组肺组织损伤减轻。染毒组肺泡上皮细胞SP-A表达的积分光密度(IOD)值明显高于对照组,同时高于治疗组。结果显示,百草枯中毒所致肺急性损伤在虎耳草水煎液的治疗下有所缓解和减轻症状。 相似文献
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常规哺乳的4头犊牛在1和5周龄时接种副流感病毒-3型(PI-3)活疫苗.4头对照牛同时用细胞培养物接种.第2次接种2周后,2组牛用PI3病毒经呼吸道攻毒.间隔采集血和鼻粘液样品.攻毒前后,用支气管肺泡灌洗法收集肺泡巨噬细胞.结果证明,接种牛病毒清除非常迅速.与对照牛相比,接种牛的杀菌活力没受影响,但几种肺泡巨噬细胞的功能在攻毒5～7天显著降低.肺泡巨噬细胞的嗜中性趋化因子接种牛攻毒后出现非常迅速,这与嗜中性细胞迅速流入这些动物的肺中是相一致的. 相似文献
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本研究旨在筛选牛体外受精胚胎早期发育差异表达基因,并进行差异表达分析。选取牛卵母细胞、体外受精8细胞期和囊胚期胚胎为试验材料,进行mRNA差异表达研究。初步克隆出4个牛卵母细胞和早期胚胎发育不同阶段差异表达的基因,同源性分析显示,它们分别与高移动样蛋白盒结构域4基因(HMGXB4)、热休克蛋白40亚家族C成员8基因(Dnajc8)、突触膜胞吐调节2基因(RI MS2)和核糖体蛋白L31基因(RPL31)高度同源。RT-PCR检测验证,HMGXB4、Dnajc8、RI MS2和RPL31在牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。 相似文献
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本试验目的是分析牛哺乳期最初几天的初乳中大小不同酪蛋白微胶粒的组成(包括α_s~-、β-、K-和γ-酪蛋白),还研究从初乳中分离出的完整的 K-酪蛋白的性质。脱脂初乳的酪蛋白微胶粒经10、30、60分的离心(100,000×g)后部分被沉淀,而经60分离心未沉淀的酪蛋白,在 pH4.6时从上清液中出现沉淀物。在含6M 尿素和硫基乙醇(4克/升)的三氯离 相似文献
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本试验旨在调查新疆石河子地区奶牛乳房炎源大肠杆菌的某些生物学特性及其耐药状况,以提高药物疗效,减少牛奶中药物的残留。试验从新疆石河子地区患乳房炎奶牛的乳样中分离纯化并鉴定出21株大肠杆菌,并对大肠杆菌分离株进行抗菌药物敏感性分析。结果表明,21株大肠杆菌对21种抗菌药物中的6种药物耐药率超过50%,其中最多的耐药15种,最少的耐药5种,耐药6及6种以上的菌株共占到76.19%。提示,该地区奶牛乳房炎源大肠杆菌对多种药物已产生了不同程度的耐药性,且存在严重的多重耐药情况。 相似文献
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Grobbel M Lübke-Becker A Wieler LH Froyman R Friederichs S Filios S 《Veterinary microbiology》2007,124(1-2):73-81
The aim of this study was to compare the in vitro antimicrobial activity of the veterinary fluoroquinolones against a panel of recently isolated porcine and bovine bacterial pathogens. The study used enrofloxacin as a benchmark against which other agents were compared, being the most common fluoroquinolone used in treatment of bovine and porcine infections. The activity of ciprofloxacin was also assessed as it is the main metabolite of enrofloxacin in cattle. Enrofloxacin and ciprofloxacin generally showed higher antibacterial activity, in terms of MIC(50) values, for most pathogen species when compared with marbofloxacin, difloxacin, danofloxacin and norfloxacin. Ciprofloxacin showed significantly greater in vitro antibacterial activity than enrofloxacin against M. haemolytica, P. multocida and E. coli, whereas enrofloxacin showed greater activity than ciprofloxacin against S. aureus. Marbofloxacin was significantly more active than enrofloxacin against M. haemolytica, E. coli and B. bronchiseptica but less active against P. multocida, S. aureus, coagulase negative Staphylococci, S. dysgalactiae, S. uberis, A. pleuropneumoniae and S. suis. Danofloxacin was significantly less active than enrofloxacin against P. multocida, E. coli, S. uberis, A. pleuropneumoniae and S. suis. Enrofloxacin and its metabolite ciprofloxacin showed the highest in vitro activities against most bovine pathogens tested and the porcine pathogens also showed a high degree of sensitivity to enrofloxacin. These data facilitate further pharmacokinetic/pharmacodynamic comparison of fluoroquinolones currently used in veterinary medicine. 相似文献
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为了使干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23 ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244 ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。 相似文献
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为原核表达副猪嗜血杆菌(H.parasuis)CDT毒素并检测其在体外培养时的分泌表达情况,本实验将切除信号肽的CDT毒素的3个亚基基因分别克隆于pET-28a载体中在大肠杆菌进行表达,并将重组蛋白经亲和层析纯化后,免疫兔制备抗血清,用于鉴定H.parasuis体外培养时CDT分泌表达情况。结果表明CDT毒素3个亚基均在Rosetta菌株中得到表达,其中cdtB约为28.2 ku,符合预期大小,而cdtA和cdtC亚基比预期的23.5 ku和17.4 ku略大。表达的3个重组蛋白可以被自然感染猪血清识别,表明其具有良好的反应原性,同时也表明H.parasuis在猪体内定殖或感染过程中分泌CDT。制备的抗血清可以与体外培养H.parasuis的分泌蛋白中的CDT亚基反应,表明重组蛋白具有良好的免疫原性,同时也表明H.parasuis体外培养时也分泌CDT。 相似文献
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为制备牛整合素β7亚基片段的多克隆抗体,根据GenBank中牛整合素β7基因序列,合成了β7亚基 288 bp(140-427 bp）的cDNA片段,通过DNA重组法构建表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。表达产物经Western blotting鉴定,结果证实成功表达了分子质量约为15 ku的β7蛋白。超声破碎细菌后,Ni-NTA树脂进行纯化,免疫兔子获得多抗。间接ELISA检测多抗效价为1∶32000,为进一步研究牛整合素α4β7的功能奠定基础。 相似文献
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建立伴大豆球蛋白酶解产生抑菌肽的最适条件,对酶解产物进行分离纯化后进一步测定其抑菌活性。采用复合风味蛋白酶水解伴大豆球蛋白,测定不同时间的酶解液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果显示:2 h水解产生的酶解肽具有抑菌活性,其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别是2.6和3.2 mg/mL。2 h水解液经Sephadex-G15分离纯化,采用平板计数法鉴定各组分。结果显示:CP2组分对大肠杆菌具有显著的抑制作用(P<0.05)。本研究证明伴大豆球蛋白的复合风味蛋白酶酶解肽具有一定的抑菌活性。 相似文献
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为了解滑液支原体（Mycoplasma synoviae，MS）甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（glycerophosphodoester phosphodiesterase，GDPD）的生物学功能，本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物，应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因，在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a（+）质粒构建原核表达载体pET-GDPD，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达，纯化表达产物并分析其酶促活性，进而制备其多克隆抗体，应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明，MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp，编码242个氨基酸，重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明，重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP）转化为对硝基苯酚，且其作用的最适pH为9.0，最佳温度为37℃，Pb2+具有较强的抑制作用，而Ca2+对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明，MS GDPD具有良好的免疫原性，可刺激新西兰兔产生高水平的抗体，血清效价高达1：160000；亚细胞定位结果表明，MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布，但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。 相似文献
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本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。 相似文献