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取本室构建的鲤生长激素毕赤酵母工程菌GS115 (pPICZαA -GH) ,甲醇诱导 ,SDS -PAGE检测 ,证明重组鲤生长激素 (RecombinantCarpGrowthHormone ,rcGH)在酵母中得到分泌表达。重组酵母菌生长曲线显示 ,细胞从培养第 8小时进入对数生长期 ,至 32hOD660 升至峰值 11.5 ,此后OD660 缓慢下降。在以 10 0 %甲醛按 0 .5 %添加量诱导至 72h、pH为 6 .0时 ,rcGH表达量最高。凝胶扫描分析 ,分泌表达的rcGH占上清总蛋白的 36 .4 1% ,表达量为 30 0～ 4 0 0mg/L发酵液。经离子交换层析法纯化表达产物 ,纯度可达 95 %。纯化的rcGH注射奥尼罗非鱼 ,结果表明具有明显的促生长作用 相似文献
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NK-lysin是毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有抗菌作用的多肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。NK-lysin的生物学功能主要由其成熟肽(m NK-lysin)决定。本文在已有斑点叉尾(Ictalurus punctatus)NK-lysin成熟肽原核重组表达载体p ET-32a(+)-m NK-lysin的基础上,通过PCR在m NK-lysin的5’端和3’端分别添加EcoRI和Xba I酶切位点,并在3’端添加6×His标签以便于纯化;扩增到的片段与表达载体p PICZαA连接构建重组表达载体p PICZαA-m NK-lysin,转化至毕赤酵母X-33细胞中,通过博来霉素筛选以及对酵母转化子基因组的PCR鉴定得到高拷贝酵母转化子;在29℃,250 rpm,采用0.5%甲醇进行诱导表达;表达产物经固化金属离子亲和层析(IMAC)获得纯化的重组体m NK-lysin。经Tricine-SDS-PAGE分析,其分子量约为11.5 k D;经Western blot分析,证明m NK-lysin在毕赤酵母中成功表达。 相似文献
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目的:为了构建鸡α干扰素基因真核和原核表达载体。方法:参照Genebank中发表的鸡源α干扰素基因进行密码子优化后,人工合成α干扰素基因片段489 bp,成功构建了干扰素基因克隆载体p MD18-T-IFN-α,经双酶切后,回收获得干扰素基因,分别与原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p GAPZαA连接,转化到大肠杆菌Ressota和毕赤酵母中,分别进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:成功构建了原核表达载体p ET-28a-IFN-α和真核表达载体p GAPZαA-IFN-α。结论:成功构建了鸡IFN-α基因的真核和原核表达载体,为鸡IFN-α干扰素的抗病毒活性研究提供了基础。 相似文献
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依据大菱鲆红体病虹彩病毒（Turbot viral reddish body iridovirus,TRBIV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）基因序列,设计了一对特异性引物,并在正反向引物中分别引入EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点,从而将PCR扩增得到的TRBIV MCP基因双酶切后定向克隆到真核表达载体pGAPZαA的GAP启动子的下游位点,并电转化入大肠杆菌DH5α宿主菌内。经抗生素Zeocin筛选、PCR、EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切以及测序分析,构建了含有α-factor信号肽的真核重组表达载体pGAPZαA MCP。重组表达质粒pGAPZαA MCP经Avr Ⅱ单酶切后电转导入毕赤酵母X-33中,挑选阳性克隆,提取表达上清经SDS-PAGE和Western-blot免疫印迹分析。结果显示,TRBIV MCP基因在酵母中成功实现分泌表达。阳性重组酵母菌经过72h诱导培养后,重组TRBIV MCP的表达量高达60.2μg/ml左右。 相似文献
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近年来,重组 VP28和 VP26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据GenBank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因,再用引物悬挂法将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到 VP28和 VP26基因的5￠端和3￠端。目的基因经双酶切后插入到表达载体pGAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化 X-33毕赤酵母感受态细胞,经 Zeocin 抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到VP28和VP26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载pGAPZαA组相比,VP28和VP26表达上清液组有明显的条带,证明VP28和VP26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。 相似文献
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鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的初步表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。 相似文献
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斜带石斑鱼抗菌肽hepcidin基因克隆及其成熟肽的原核融合表达 总被引：1，自引：0，他引：1
文章根据已报道的硬骨鱼类hepcidin cDNA序列设计简并引物,通过RT—PCR从重要海水经济鱼类斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝脏中扩增出1条具有完整开放阅读框的246bpcDNA序列,Blast分析表明该序列是鱼类hepcidin基因家族的一员,被命名为斜带石斑鱼hepcidin样抗菌肽前体,该cDNA所推导的氨基酸序列有如下特点：1）信号肽序列与多数鱼类hepcidin信号肽的同源性在67％～87％之间;2）C端20个氨基酸序列具有绝大多数动物hepcidin成熟肽的共同典型保守序列特征,即在对应位置具有8个Cys;3）序列中不具有已报道的hepcidin前体肽转化酶作用典型基序[RX（K／R）R];4）与GenBank中已注册的2条斜带石斑鱼hepcidincDNA序列（GU391241和GU391242）所推导的氨基酸序列同源性分别为36％和33％,且NJ进化树显示不与这2条序列聚为一枝,表明该序列是斜带石斑鱼hepcidin基因家族中一种新亚型,其预测成熟肽融合表达载体成功在大肠杆菌（Escherichiacoli）中表达,为后续研究奠定基础。 相似文献
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根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。 相似文献
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采用逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）方法，从牙鲆（Paralichthys loivaceus)肝脏总RNA中扩增出干扰素调节因子（fIRF)的核心区序列，定向插入质粒pUC18，克隆的牙鲆IRF cDNA序列分析表明，与Yabu报道的牙鲆IRF cDNA相比有1个碱基差异，但与推断的氨基酸序列完全一致，将牙鲆IRF的核心区序列 cDA定向插入原核表达载体pBV220，构建成牙鲆IRF表达载体pBVfIRF22，SDS－PAGE分析表明，经42度诱导，含pBVfIRF22质粒的大肠杆菌可表达一分子量约12000的特异蛋白。 相似文献
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Abstract– Lake Ashbaugh, located in northeast Arkansas, was constructed in 1981, and initially stocked with Florida largemouth bass followed by supplemental stockings of northern largemouth bass. Allele frequencies of three discriminant allozyme loci (sAAT-B, sIDH-B, sMDH-B) between Florida and northern largemouth bass were determined for 414 largemouth bass collected between 1994 and 1996. Fx bass dominated our sample, with 62.3% possessing Florida largemouth bass alleles. A high incidence of Hardy-Weinberg disequilibrium was observed, indicative of genetic change within the population. No significant differences were identified for frequency of age classes, relative weight, and length at age between the northern, F1 and Fx phenotypes. Despite being located north of what is generally considered suitable for stocking Florida largemouth bass, it was demonstrated that temperature is not selective at present against bass possessing Florida largemouth bass alleles. However, caution should prevail when introducing non-native stock into native gene complexes, as introduced genes persist through many generations. 相似文献
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大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大口黑鲈(Micropterussalmoides)中的病毒性溃疡综合征,本研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouthbassulcerativesyndromevirus,LBUSV)主要衣壳蛋白(MCP)基因,该基因编码区全长1392bp。通过序列比较分析,在MCP基因内确定了一段241bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物,经过优化PCR反应条件,建立了可以快速检测大口黑鲈溃疡综合征病毒的PCR方法。实验表明,在PCR进行到30个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是104拷贝数/μL,相当于104个病毒粒子。利用该方法,从天然感染LBUSV的大口黑鲈脾脏组织DNA可扩增出241bp的片段,而健康大口黑鲈和感染了传染性脾肾坏死病毒样病毒的大口黑鲈脾脏组织则没有扩增条带。本研究建立的PCR检测方法具有检测快速、成本低、准确性高的特点,适用于大范围早期病害诊断的推广应用。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7基因真核表达载体pCI-VP7的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
将编码草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)主要衣壳蛋白VP70.9kb的基因片段连接至克隆载体pMD19-T中,筛选阳性克隆并测序,经检测为正确序列后,再将目的片段克隆入真核表达载体pCI,筛选得到阳性重组质粒pCI-VP7。然后构建pCI-VP-GFP重组表达质粒(即GFP基因与VP7的一段上游基因融合表达),用PCR及酶切方法鉴定克隆的正确性。并用脂质体法将其转染入真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及RT-PCR特异性检测。结果表明,GFP基因与VP7的一段上游基因被成功转染到COS-1和CIK细胞,并得到了很好的表达。进而证明pCI-VP7可以成功的表达,为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。 相似文献
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运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70(tilapia heat shock protein,tHSP70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物HSP70的相似性,以人工合成cDNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整CDS,并将此DNA片段与真核表达载体pGAPZa-A连接,构建pGAPZa-HSP70表达质粒,在毕赤酵母GS115中表达tHSP70蛋白,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析后,采用Ni2+IDA层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化PAS染色鉴定。对表达的蛋白进行SDS-PAGE后,将所获得的非预定大小(约100 ku)条带进行电离飞行时间质谱鉴定,并确定其蛋白种类。结果表明:tHSP70所含氨基酸数量为640,分子量为70 274.5 u,等电点为5.49。在哺乳动物网织红细胞(体外)的半衰期为30 h,在酵母内半衰期大于20 h,而在大肠杆菌内的半衰期也大于10 h,不稳定指数为36.64,脂肪族指数为85.58。可能分别含有6个N-和O-糖基化位点,所克隆tHSP70基因与目的基因完整编码区序列完全一致,所构建的pGAPZa-HSP70质粒能在GS115中成功表达,诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western-blotting分析后发现,除70 ku目的蛋白外,还出现一条100 ku条带。经糖基化PAS染色证明,此100 ku蛋白可能是HSP70糖基化的结果,且能被人的兔抗HSP70抗体识别,质谱鉴定证明该条带即是tHSP70蛋白。本研究所表达tHSP70蛋白为后续罗非鱼细胞学及抗原提呈等免疫学研究奠定了基础。 相似文献
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A 74‐day experiment was conducted to evaluate the production performance and water quality variation in three types of farming system for largemouth bass Micropterus salmoides. The tested aquaculture models included monoculture of largemouth bass (MC), polyculture of largemouth bass, gibel carp Carassius auratus gibelio and silver carp Hypophthalmichthys molitrix (PC), and integrated culture of largemouth bass, gibel carp, silver carp and freshwater pearl mussel Hyriopsis cumingii (IC). The ratio of largemouth bass, gibel carp and silver carp was 30:2:1 in the PC model, and the ratio of largemouth bass, gibel carp, silver carp and mussel was 30:2:1:5 in the IC model. The largemouth bass were fed with formulated feed twice daily. No significant differences were found in weight gain and yield of largemouth bass, total fish yield, nitrogen (N) and phosphorus (P) utilization efficiencies, N and P wastes, pH, nitrite, nitrate, reactive phosphate, total nitrogen, total phosphorus, total organic carbon, chemical oxygen demand, 5‐day biochemical oxygen demand, chlorophyll a, primary productivity among the MC, PC and IC models. The ammonia was lower, while the dissolved oxygen was higher in the PC tanks than in the MC tanks. These results suggest that the environment situation was better in the PC tanks relative to that in the MC tanks. The present study reveals that the PC model should be a way to optimize the aquaculture model for commercial largemouth bass farming. 相似文献
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《水生生物资源》2001,13(6):439-447
Measurement of total body electrical conductivity (TOBEC) recently has been used to estimate the body composition of several fish species in a noninvasive manner. The present study was conducted to evaluate the use of TOBEC in estimating body composition of largemouth bass (Micropterus salmoides). A total of 85 largemouth bass weighing 154 to 3 245 g were measured for electrical conductivity after which their proximate composition was determined by chemical means. Significant linear relationships existed between the natural logarithm of whole-body ash, lean body mass, lipid, protein, and water content and the natural logarithm of length and/or weight with r2 values ranging from 0.860 to 0.999. Inclusion of the TOBEC value did not significantly improve the prediction accuracy of these models. Equations were developed to allow the prediction of body composition of largemouth bass based on length and weight measurements. Prediction models including only length and weight as variables provided estimates of body components of an independent set of fish that were not significantly different from chemically derived measurements of these components. These models should allow the rapid, nondestructive estimation of body composition of largemouth bass varying in size and condition without the added cost and processing time associated with measurement of TOBEC, although large prediction errors might prevent the detection of ecologically significant differences in body composition. However, with additional data involving narrower fish-size ranges and constant temperatures for the development of prediction equations, TOBEC may improve the prediction accuracy of body composition estimates for largemouth bass. 相似文献
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加州鲈肌肉生长抑制素(MSTN)cDNA的克隆和序列分析 总被引：1，自引：2，他引：1
肌肉生长抑制素是抑制肌肉生长和发育的生长调控因子。对运用RT-PCR和RACE技术从加州鲈成鱼肌肉总RNA中扩增得到的MSTN cDNA全序列进行了序列分析。结果表明,加州鲈MSTN cDNA全长为1626bp,其开放阅读框为1 134bp,共编码377个氨基酸,前面的22个氨基酸为信号肽,中间有四个氨基酸(RARR)为蛋白水解加工位点;该基因总共有13个半胱氨酸残基,后面9个在蛋白水解加工位点之后的C端生物活性区,与其它脊椎动物比较,它们的位置完全一致,对该基因的结构和功能非常重要。与GenBank中已知的条纹狼鲈、金鲷、斑马鱼、虹鳟、斑点叉尾鮰、人、猪、鸡、鸽MSTN的ORF相比较,核苷酸序列同源性为63%~94.4%,氨基酸同源性为61.4%~96%,特别是在C端生物活性区氨基酸同源性为88.1%~100%,高度的保守性反映了该基因受到了高度的进化限制以及功能的重要性。加州鲈MSTN基因的克隆为研究该基因打靶和鱼类肌肉发育调控机理奠定了基础。 相似文献