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1.
本研究旨在研究猪新天然免疫相关基因Akirin2所表达的蛋白在细胞中的定位,以及在受到外源刺激物LPS刺激时,对细胞因子IL-6和IL-1β mRNA表达的影响.本试验用实验室构建好的pEGFP-Akirin2真核表达载体转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用激光共聚焦显微镜分析Akirin2在SUVEC的定位,并用LPS作为外源刺激物刺激转染Akirin2基因的细胞,荧光实时定量分析细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量的变化.结果表明,Akirin2基因编码的蛋白严格定位于细胞核之内,并在核仁区有明显表达,在LPS刺激后,Akirin2基因对细胞因子IL-6和IL-1β mRNA表达量都具有明显上调作用.本研究证实了Akirin2蛋白的亚细胞定位及其对细胞因子表达的影响,为Akirin2基因的作用机制的进一步研究奠定了基础. 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(15)
为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。 相似文献
3.
为研究Akirin2基因在鸭生物体中的功能,本试验通过RT-PCR扩增了鸭Akirin2基因,并采用荧光定量PCR方法检测了其在40日龄北京鸭不同组织中的表达差异.序列分析结果表明,鸭Akirin2基因CDS区全长594 bp,编码197个氨基酸,氨基酸水平上与鸡的相似性达99%,其氨基酸序列二级结构具有哺乳动物Akirinl和Akirin2氨基酸二级结构域的共同区域;荧光定量结果表明,鸭Akirin2在肌肉和免疫器官脾脏中都有表达.以上结果支持了鸟类Akirin2可能具有与哺乳动物中Akirin1和Akirin2共同功能的观点,为进一步研究Akirin2基因在鸟类肌肉发育中的作用奠定了基础. 相似文献
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本研究旨在克隆猪细胞周期蛋白A基因(CyclinA),并在猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)中表达,以验证其功能。以人的CyclinA基因为信息探针,经电子克隆得到猪CyclinA基因,通过RT-PCR和DNA测序验证电子克隆结果并对其作生物信息学分析,用RT-PCR、Westernblot研究它在SUVEC中的表达情况。应用激光共聚焦显微镜分析它在细胞中的亚细胞定位,并通过流式细胞仪分析细胞周期以及用MTS法测定细胞的增殖能力。结果如下:核酸测序证明RT-PCR产物同电子克隆结果相符。该cDNA包含1299bp的完整开放阅读框(ORF),共编码432个氨基酸,经NCBIBLAST分析,该基因定位于猪的8号染色体上。Westernblot结果显示CyclinA基因编码蛋白的相对分子质量大小约为40ku,亚细胞定位研究表明该蛋白定位于细胞核中。经流式细胞仪分析表明稳定表达该基因的细胞,其G1期的细胞数量比对照组细胞增加了15%～20%,而S期的细胞数量比对照组细胞减少了约18%;MTS法检测显示细胞株SUVEC-CycAGFP的增殖活性明显高于对照组细胞。作者成功克隆到新基因猪源细胞周期蛋白A,并验证了其生物学功能,为今后开展病毒感染对猪细胞周期蛋白A影响的研究奠定了基础。 相似文献
5.
试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。 相似文献
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旨在分离猪PYGO2编码区序列，获悉该基因mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征、细胞中的分布和定位，并构建蛋白相互作用网络。本研究首先利用RT-PCR从成年版纳微型猪近交系（BMI）睾丸组织中克隆PYGO2编码区序列；利用生物信息学解析其基因结构并对蛋白质进行多种功能分析，比较多个哺乳动物PYGO2的氨基酸序列同源性，构建系统进化树和蛋白质相互作用网络；然后利用qPCR技术检测PYGO2在15个组织中的mRNA表达情况；最后通过构建pEGFP-C1-PYGO2融合表达载体，转染猪睾丸细胞（ST），确定PYGO2的亚细胞定位。结果表明，PYGO2基因CDS长1 221 bp，编码406个氨基酸（基因和氨基酸号分别为KY644518和AVB77243.1），定位在猪4号染色体；PYGO2蛋白二级结构以无规则卷曲为主，N端和C端均疏水；氨基酸序列同源比对分析表明，猪PYGO2与其他哺乳动物的相似度均大于97%，在进化上高度保守；蛋白互作网络分析显示，猪PYGO2与9个蛋白可能存在相互作用，其中与BCL9蛋白作用最为紧密；qPCR表达分析表明，猪PYGO2在被检的15个组织中均有不同程度表达，在生殖腺中表达相对较高；ST细胞中的亚细胞定位结果表明，PYGO2 mRNA主要分布在细胞核。本研究获得了PYGO2基因的编码序列，蛋白质结构和定位，蛋白质相互作用网络，mRNA多组织表达特征，可为进一步解析该基因在猪精子生成中的分子机制提供参考。 相似文献
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猪瘟病毒石门株E2基因在永生化猪血管内皮细胞的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用DNA重组技术将猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E2基因定向插入逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2。将pBABE-puro-E2和辅助质粒pVSV-G经磷酸钙共沉淀法转染293GP包装细胞系,将其包装为完整的逆转录病毒假病毒;用包装好的假病毒在polybrene的介导下转导第30代的永生化猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）,用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并将筛选出的阳性细胞腹腔免疫BALB／c小鼠。RT-PCR检测SUVEC内的E2基因,用间接免疫荧光试验鉴定E2蛋白在SUVEC上的表达,间接ELISA试验检测小鼠血清抗体。结果表明,CSFVE2基因导入猪脐静脉血管内皮细胞获得表达,而且成功诱导小鼠产生抗E2蛋白的抗体。 相似文献
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本研究旨在分离鉴定猪胰脂肪酶相关蛋白2(Pancreatic lipase-related protein 2,PNLIPRP2)基因,并对其分子特征及在主要组织中的表达分布进行探讨.利用电子克隆和RT-PCR技术克隆出猪PNLIPRP2基因编码区(CDS)全长,并将序列提交到GenBank;采用GENSCAN等软件和NCBI等在线资源对其及其预测编码蛋白序列进行生物信息学和比较基因组学分析;同时利用半定量PCR技术分析该基因在2月龄大白猪12种组织中的表达情况.结果表明,猪PNLIPRP2基因CDS全长1416 bp(EU715062),编码471个氨基酸,含有1个保守的甘油三酯脂酶抑肽酶PLAT结构域(PLAT-PL),在进化上与人、黑猩猩PNLIPRP2的遗传距离较近.进一步分析显示,该基因定位于猪14号染色体,含有12个外显子和11个内含子.另外,猪PNLIPRP2在小肠中表达量最高,脑、脂肪中次之,骨髓、胃中表达量较低,在其它组织中几乎不表达.本研究对猪PNLIPRP2基因CDS进行了克隆,初步分析了该基因的结构与表达特征,结果提示,猪PNLIPRP2可能是与脂肪沉积和免疫调节密切相关的重要候选基因. 相似文献
10.
本研究旨在阐明猪SRPK1基因的分子特点和表达谱。以大白猪为研究对象,利用RT-PCR技术克隆SRPK1基因CDS区域,同时利用反向PCR(inverse PCR,I-PCR)技术得到猪部分SRPK1的5′UTR序列;利用生物信息学方法分析SRPK1基因核苷酸序列及编码蛋白序列的结构特点;利用荧光定量PCR(real-time PCR)检测SRPK1在1和30日龄大白猪及杜洛克的心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、小肠、大肠、脑的表达情况;构建猪骨骼肌损伤模型,研究在骨骼肌发育过程中SRPK1基因的表达特性。结果,将克隆片段拼接得到长2499bp的大白猪SRPK1基因序列,包含了1968bp完整CDS区域,分析表明其编码含656个氨基酸的蛋白质;包括2个P_Kc结构域,猪SRPK1蛋白序列与人和黑猩猩的相似性较高。通过生物信息学方法预测所得5′UTR含有多个转录结合位点:HSF1、HSF2、Ik-1、IK-2、SRY、SP1MyoD、USF、E47、p300、CP2、RREB-1、E2F和AP-1。利用荧光定量PCR研究发现,表达结果显示猪该基因表达具有组织和种间特异性,主要都是在胃、大肠和小肠中表达。SR-PK1基因在整个损伤修复过程中的表达反复出现升高和降低。5′UTR处有多个和肌肉生长相关蛋白的转录结合位点,主要在消化系统组织表达,在骨骼肌修复中表达上调,推测其可能与骨骼肌细胞发育或其他肌肉生长相关因子的表达有关。 相似文献