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【目的】 研究玉米开花期不同耐旱性玉米自交系的蛋白质表达差异,分析玉米响应干旱胁迫的主要代谢途径并发掘有价值的耐旱基因,对响应干旱胁迫的差异表达蛋白质组进行筛选和鉴定分析。【方法】 以强耐旱系PHBA6和弱耐旱系吉63为材料,设计干旱胁迫和正常灌溉处理。在玉米开花期进行干旱胁迫处理,取雄穗小花提取蛋白经双向凝胶电泳分离、凝胶图像扫描和质谱分析。【结果】 质谱分析共筛选出542个高清晰、重复性强的蛋白质点。其中,差异表达丰度达2.0倍以上的蛋白质点共有59个,强耐旱系PHBA6中有26个,弱耐旱系吉63中有37个,在强耐旱系PHBA6与弱耐系吉63中都表达且差异显著的蛋白质点有4个。【结论】 干旱胁迫蛋白参与代谢物和能量前体合成、核苷酸代谢、氧化还原辅酶代谢过程、蛋白翻译调控、细胞蛋白质及氨基酸代谢过程的调控、含硫化合物的合成与代谢过程、半胱氨酸的生物合成及代谢过程和光合作用等。细胞组分分类显示二者中的差异蛋白都与叶绿体及其结构相关,而且差异蛋白的细胞组分分类一致,但在生物学代谢过程及分子功能分类上相差较大,这些显著的差异表达的蛋白可能是形成不同品系间耐旱性强弱的主要原因。 相似文献
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【目的】 筛选新疆野苹果响应NaCl胁迫相关差异miRNA及靶基因。【方法】 以新疆野苹果组培苗为材料,对150 mmol/L NaCl处理6和48 h时的新疆野苹果幼苗叶片进行small RNA测序。【结果】 NaCl处理6 h时3个miRNA差异表达,其中2个上调表达,1个下调表达,miRNA对应的靶基因数目为64个;NaCl处理48 h时13个miRNA差异表达,其中4个上调表达,9个下调表达,miRNA对应的靶基因数目为108个。对差异靶基因进行GO和KEGG分类注释,NaCl处理6 h时,GO主要富集包括:肌醇磷酸2激酶活性、寡糖基转移酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂活性、木聚糖生物合成过程等;NaCl处理48 h时,GO主要富集包括:氧氧化还原酶活性、DNA结合、质外体、次生代谢过程等。KEGG共同富集在N-glycan生物合成通路。【结论】 mdm-miR168b、mdm-miR159c、mdm-miR827、mdm-miR390f、mdm-miR171i、mdm-miR399j基因在NaCl处理6和48 h时表达量存在差异,其中mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095表达量呈负相关,3个miRNA参与了新疆野苹果对NaCl胁迫的响应过程。 相似文献
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意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的免疫应答 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】通过对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）胁迫的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T）转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log2 fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）验证转录组数据的可靠性。【结果】 差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为mRNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-qPCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。 相似文献
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【目的】 运用现代分子生物学及高通量测序技术,在全基因组水平鉴定耐旱相关的基因,研究玉米雄穗花器官分化期对干旱胁迫的响应机理, 为抗旱育种将提供新的理论基础。【方法】 以干旱胁迫15 d和正常浇水的耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63” 花器官分化期的雄穗进行Illumina HiSeq 2000高通量测序分析,将测序得到的Unigene与玉米参考基因组进行比对,利用 RPKM 来衡量样本间的基因表达丰度, 以|log2foldchange|≥1,P<0.05,FDR≤0.001筛选出样本间的差异表达基因, 并通过 Gene Onto 1ogy (GO ) 数据库、 KEGG pathway 数据库对筛选出的差异表达基因的功能和参与的调控路径进行分析。【结果】 与正常水分处理相比,耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”在干旱胁迫下分别有1 394个和1 300个显著差异表达基因,其中共有差异表达基因831个,包括上下调表达趋势是一致的822个基因和9个具有相反的表达模式基因。除这些基因外,各自分别还有563个和469个基因型特异的干旱响应基因,这些特异的干旱响应基因的G0 富集分析的条目并不完全相同,除共同富集在刺激响应,细胞壁改变外,耐旱自交“PHBA6”还富集在激素合成调控,机氮化合物代谢、蛋白结合上,特异的干旱响应基因的KEGG 显著性富集分析在2个自交系中也不完全相同,耐旱自交“PHBA6”还有部分差异基因富集在生物素代谢通路上,另外,筛选出耐旱自交“PHBA6”中在干旱胁迫下差异表达的3个脱水素基因和3个特有差异表达的bZIP、MYB和ERF转录因子。【结论】 胁迫相关基因的特异性响应可能是材料间耐旱性存在差异的主要原因,耐旱自交“PHBA6”中的3个脱水素基因和3个特有差异表达的bZIP、MYB和ERF转录因子基因在玉米耐旱育种中可能有重要的利用价值。 相似文献
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【目的】建立绵羊(Ovis aries)诱导性多能干细胞系,为绵羊转基因育种、应用绵羊诱导性多能干细胞奠定基础。【方法】利用电转将OCT4、SOX2、KLF4、l-Myc、Lin28转染至绵羊成纤维细胞中并诱导培养至有光滑隆起、边缘整齐的细胞克隆,形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色以及实时荧光定量PCR检测克隆细胞的生物学特性;利用高通量测序技术对诱导0、10、20、30 d的阳性细胞的差异表达基因进行筛选。【结果】克隆细胞中SOX2、OCT4、SSEA-1蛋白免疫荧光染色均呈阳性; OCT4、SOX2、Nanog基因表达量均极显著高于成纤维细胞;0和30 d转录组测序表明,被注释到GO数据库的差异表达基因有9 465个,其中,上调基因6 987个,下调基因2 478个;KEGG分析共有5 773个基因注释到259个通路中,其中,P53信号通路显著富集,且其在干细胞增殖方面起着非常重要的作用。【结论】初步成功建立了绵羊诱导性多能干细胞。 相似文献
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【目的】对高温胁迫下萝卜幼苗进行转录组测序分析,筛选不同耐热性萝卜品种间的差异表达基因,为阐明萝卜幼苗响应高温胁迫的分子机制提供理论参考。【方法】以耐热萝卜品种1116T和热敏感萝卜品种Wr129为对象,对其进行高温（40℃）胁迫处理0（常温,对照）和24 h,提取各时间点样品总RNA进行转录组测序,以|log2 FoldChange|≥1,P<0.05且TPM≥10为标准,筛选出差异表达基因（DEGs）,并进行GO功能注释和KEGG代谢通路富集分析。【结果】随着高温胁迫时间的增加,Wr129和1116T幼苗茎叶逐渐发生萎蔫,胁迫24 h后Wr129叶片萎蔫下垂且干枯变黄,而1116T叶片轻度萎蔫下垂,仍保持绿色。12个文库共获得81.45 Gb Clean data,平均有62.30%的reads比对到萝卜参考基因组的一个位置。从2个不同耐热性品种中共鉴定到2701个差异表达基因。GO功能注释结果显示,2629个差异表达基因在GO数据库中得到注释,其中,有559个差异表达基因被注释为细胞组分类别中的叶绿体被膜、叶绿体基质和叶绿体类囊体3个条目,470个差异表达基因被注释为与胁迫响应相关的生物学过程。KEGG代谢通路富集结果显示,1166个差异表达基因富集到124条代谢通路,其中,有74个差异表达基因富集到光合作用和光合作用-天线蛋白代谢通路,23个基因富集到卟啉和叶绿素代谢通路,大部分基因在高温胁迫下被诱导; 35个差异表达基因富集到谷胱甘肽代谢途径,其中14个谷胱甘肽-S-转移酶基因（GSTs）在高温胁迫下上调表达。高温胁迫24 h,Wr129和1116T幼苗叶片PSII的最大光化学效率（Fv/Fm）和总叶绿素含量均下降,但1116T的下降幅度较小。【结论】 Wr129和1116T的耐热性存在明显差异,其原因是1116T植株可通过调控光合作用和抗氧化系统相关基因的表达,减缓Fv/Fm和叶绿素含量下降速率,从而提高植株对高温胁迫的耐受能力。 相似文献
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【目的】为棉花抗枯萎病分子育种的基因来源提供依据。【方法】根据前期转录组测序和抗病表达数据,从棉花EST数据库中筛选出抗枯萎病有关的基因(登录号为CD486053)序列,在NCBI搜索与该基因同源性为94%的海岛棉抗病相关PR10基因(登录号为AY588276)并设计引物,从枯萎病接菌的抗病海岛棉材料“06-146”克隆一个海岛棉同源基因,命名为GbPR10基因。进行生物信息学和在枯萎病菌、乙烯、水杨酸处理下基因表达量分析。【结果】GbPR10基因有480 bp的ORF序列,编码159个氨基酸。该蛋白序列中具有PR10蛋白特有的Bet-v1结构域和改变的甘氨酸环P-Loop(GXGGXG)。蛋白质序列同源比对表明该蛋白与其他生物PR10蛋白有较高的一致性。亚细胞定位预测表明GbPR10分布于细胞质。qRT-PCR表达分析表明,GbPR10基因在不同抗病海岛棉品种的不同组织上表达量不均匀而较高于感病海岛棉品种;在乙烯和水杨酸处理的1对抗/感海岛棉根系中,抗病品种出现先上调后下调趋势,感病材料后期诱导表达,抗病品种的表达量几乎高于感病品种。【结论】GbPR10基因在海岛棉抗枯萎病信号途径中起重要作用。 相似文献
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【背景】柑橘溃疡病（citrus bacterial canker,CBC）是世界柑橘产业上危害最严重的病害之一,由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起,在国内外被列为检疫对象。由于柑橘分子病理研究相对滞后,导致可供利用的抗性基因资源相对匮乏。WRKY转录因子参与植物抵御生物和非生物胁迫反应,前期研究发现柑橘WRKY转录因子可能在调控寄主抗病反应中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72转基因晚锦橙（Citrus sinensis）的溃疡病抗性进行评价,明确这些基因在柑橘响应溃疡病菌侵染中的生物学功能和抗病育种价值。进一步利用RNA-Seq解析CsWRKY61调控的信号通路。【方法】利用农杆菌介导法进行柑橘遗传转化,获得超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72的晚锦橙;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析转基因植株中目的基因的表达水平以及拷贝数;以非转基因植株为对照,采用离体针刺接种评价转基因植株对溃疡病的抗性;通过比较超量表达CsWRKY61和野生型植株的转录组测序结果,探究CsWRKY61提高柑橘溃疡病抗性的内在机制。【结果】分别构建了CAMV 35S启动子控制CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72表达的植物表达载体,通过GUS组织化学染色和PCR鉴定分别获得了6、8和6株转基因晚锦橙。转基因植株中目的基因的表达量有不同程度的提高,大部分转基因植株中外源基因的拷贝数为1,只有超量表达CsWRKY61的转基因植株溃疡病抗性显著增强,其病斑面积明显小于野生型植株,而超量表达CsWRKY50和CsWRKY72的转基因植株抗病性与野生型相比无明显差异。转录组分析结果显示,超量表达CsWRKY61的转基因植株中生物胁迫相关途径（包括病原入侵的感知、活性氧爆发、转录因子、防御基因、激素、细胞壁和次生代谢等）和信号转导相关途径（主要是激酶受体）均被显著激活。【结论】超量表达CsWRKY61能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径,增强柑橘对溃疡病的抗性;CsWRKY61在柑橘抗病育种中存在潜在的应用价值。 相似文献
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【目的】 二氧化硫（SO2）处理可有效防治葡萄灰霉病和采后腐烂,但会导致浆果脱落,研究SO2引起葡萄浆果脱落的分子机制,明确关键基因和转录调控机制。【方法】 使用SO2处理‘巨峰’葡萄,分别在2、4和6 d进行采样并统计对照组（CK）和SO2处理组的葡萄浆果脱落率。通过高通量测序技术对CK对照组和SO2处理组‘巨峰’葡萄采后2、4和6 d的样品测序,以葡萄基因组作为参考基因组进行序列比对,利用TPM算法计算基因表达量,使用基因集富集分析（GSEA）、基因共表达网络（GCN）以及转录调控网络预测方法对转录组数据进行系统的分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其表达量进行验证。【结果】 SO2处理能够显著诱导葡萄浆果脱落,2 d时,SO2处理的葡萄浆果脱落率为9.88%,4 d时达到19.24%,且均显著高于对照组,6 d时脱落率达到38.25%,而对照组脱落率仅11.85%。通过GSEA分析,发现在CK组富集的GO生物过程主要与氧化应激反应、细胞壁代谢以及苯丙氨酸代谢通路相关,其中4 d时CK组富集到植物细胞壁组织、果胶代谢、细胞壁修饰、聚半乳糖醛酸等通路。在SO2组富集的GO生物过程主要与能量代谢通路相关,其中2 d时在SO2组富集到光合作用、四吡咯代谢、前体代谢物和能量的产生、葡萄糖代谢等通路。CK组富集的KEGG代谢通路主要有戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换、半乳糖代谢、植物激素信号转导、柠檬酸循环（TCA循环）等,SO2组有光合作用、柠檬酸循环（TCA循环）、糖酵解等。GCN将GSEA分析中的领头基因分为12个水平,水平4—9均富集到了能量代谢、糖代谢相关通路,其中水平4富集到激素反应、氧化应激反应。对GCN关键水平中的基因启动子序列进行转录调控预测分析,结果显示95个转录因子（TFs）与269个靶基因存在987对调控关系。WRKY14、WOX8、KUA1在SO2处理下持续下调,MYB60、MYB73、ANL2、ERF2、DOF3.6、GATA25、WRKY57、KAN2、ATHB6在SO2处理后持续上调。此外,MYB15、WRKY11、WRKY33、WRKY40、WRK75先上调后下调。ERF2、MYB60和WRKY40的转录调控网络发现调控的靶基因涉及细胞壁代谢、糖代谢等相关途径。qRT-PCR结果显示PME36和ERF2上调表达趋势相似,GAUT7、MYB60、UGE3上调表达趋势相似,此外,WRKY40在SO2处理的2和4 d被诱导上调,PPME1、COMT1表达持续下调,SO2处理4 d时LAC15被显著诱导上调。【结论】 SO2诱导营养物质代谢、能量代谢、细胞壁代谢途径相关基因的表达,该过程受到多种转录因子调控,最终导致葡萄浆果脱落。 相似文献
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【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一，论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异，为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序，之后采用生物信息学分析，分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考，以|log2FC|≥1,P-adjust<0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因，利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1 945个基因上调表达，有9、302和1 784个基因下调表达；玉米分别有293、692和1 426个基因上调表达，320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示，侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长，差异基因主要富集在... 相似文献
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【目的】研究添加人工饲料后不同食料饲养的双尾新小绥螨实验室种群对不同猎物的取食影响,分析人工饲料在双尾新小绥螨实验室种群扩繁和释放中的作用。【方法】采用小室法观察在有无人工饲料条件下,自然猎物、替代猎物和人工饲料饲养的双尾新小绥螨种群对目标猎物的捕食选择性和取食量差异,采用偏好性系数理论公式和影响系数,分析人工饲料与猎物共存时对双尾新小绥螨捕食作用的影响。【结果】人工饲料的添加导致双尾新小绥螨的自然猎物饲养种群和替代猎物饲养种群对替代猎物腐食酪螨的取食率降低;3个种群对自然猎物土耳其斯坦叶螨的选择及取食率无显著影响。自然猎物饲养种群对土耳其斯坦叶螨的取食量显著高于其他两种饲养种群,无人工饲料时,自然猎物饲养种群对土耳其斯坦叶螨取食率最高可达83.33%,提供人工饲料时,自然猎物饲养种群对土耳其叶螨的取食率最高可达79.33%;替代猎物饲养种群对腐食酪螨的取食量显著高于自然猎物和人工饲料饲养种群,无人工饲料存在时,替代猎物饲养种群对腐食酪螨的取食率最高可达63.33%。【结论】人工饲料作为双尾新小绥螨的营养补充添加,并不会影响其对土耳其斯坦的防治效果,实验室饲养中作为营养补充添加,可以降低对替代猎物腐食酪螨的消耗。双尾新小绥螨前期的取食经历对其后期的猎物选择及取食量具有重要的作用。 相似文献
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褐飞虱一个新的海藻糖合成酶基因的特性、 发育表达及RNAi效果分析 总被引：1，自引：1，他引：0
背景 昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）基因。前期研究发现褐飞虱（Nilaparvata lugens）中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。目的 通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。方法 对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长cDNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰（RNAi）技术抑制TPS3的表达。结果 在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,dsTPS3能有效抑制TPS3的表达。结论 在褐飞虱中发现一个新的TPS（TPS3）,其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3个TPS在发育过程中行使的功能不同。RNAi能够有效抑制TPS3的表达并导致褐飞虱蜕皮障碍和翅发育畸形。 相似文献
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【目的】NS3编码的蛋白是水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）RNA沉默抑制子。笔者前期研究发现,转NS3本氏烟（Nicotiana benthamiana）对RSV有一定的抗性。为深入揭示NS3在寄主体内的作用机制,本文将进一步探究转NS3本氏烟对其他烟草病害的抗性。【方法】以野生型本氏烟和转NS3本氏烟为试验材料,通过农杆菌浸润法接种马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）侵染性克隆,观察病毒症状,抽提系统发病叶片总RNA,并利用RT-qPCR方法检测病毒的相对积累量;采用灌根接种法分别接种烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）,观察植株表型并统计发病率和病情指数。【结果】PVX侵染本氏烟后,植株叶片主要表现为花叶、褪绿等症状,NS3表达植株与野生型植株具有相同的PVX症状表现。在接种PVX 10 d后,RT-qPCR检测发现与野生型植株病毒积累量相比,NS3表达抑制了PVX在本氏烟体内的积累水平,两个转NS3株系（NS3-6、NS3-9）中PVX的相对积累量分别为野生型植株的68.17%和81.01%。青枯病菌在野生型植株和转基因植株上均引起萎蔫、猝倒等典型的病害症状,且两者的症状无明显差异。在青枯病菌侵染早期,NS3表达在一定程度上利于病菌的侵染,表现出对青枯病较为敏感;而在接种14 d,野生型植株的发病率为100.00%,病情指数为78.67,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为95.00％、98.33％,病情指数分别为70.00、73.00;14 d之后发病率和病情指数逐渐升高,而NS3表达株系的病情指数均低于野生型植株。黑胫病菌在野生型植株和转基因植株上均为在茎基部出现黑褐色坏死斑等典型病害症状,且NS3表达也不影响本氏烟的症状表现。在黑胫病菌的侵染初期,NS3-6株系的发病率高于野生型植株;但在整个黑胫病发生过程中,转NS3株系的病情指数均低于野生型植株,在接种12 d,野生型本氏烟的发病率为96.67％,病情指数为77.50,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为90.00％、86.67％,病情指数分别为64.17、62.08。【结论】通过病原侵染过程观察表明NS3表达在一定程度上影响了烟草病害在本氏烟上的侵染和严重程度,且对不同病原菌的影响不同。 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。 相似文献
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目的 分离越橘VcNAC072（NAM,ATAF1/2,CUC2）转录因子,分析其表达模式并探讨其在调控花青素合成过程中的功能,为进一步研究越橘花青素积累的调控机理提供理论基础。方法 以‘公爵’越橘（Vaccinium corymbosum ‘Duke’）为试材,克隆VcNAC072。通过农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥花青素积累的差异。利用酵母单杂交和瞬时表达试验,分析VcNAC072对MYB转录因子AtPAP1的转录调控。结果 克隆获得越橘VcNAC072,该基因CDS为1 032 bp,编码含有343个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的NAC结构域。表达分析显示,该基因在不同发育阶段的果实中均可表达,但表达差异明显,在粉色和蓝色果实中表达量较高,在绿色果实中表达量最低。随着VcNAC072表达的升高,果实中花青素含量呈递增的趋势。分析AtPAP1启动子序列,发现其序列中包含NAC转录因子的结合位点。酵母单杂交和烟草瞬时表达试验结果表明,VcNAC072可与AtPAP1的启动子相互作用,并激活其表达。在野生型拟南芥中异位表达VcNAC072,其种子中花青素积累量显著高于野生型。结论 推测VcNAC072在越橘果实中正向调节花青素的积累。 相似文献