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产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、LTB基因的融合,LTB基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-LTB、pBI121-STI-STII-LTB通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-LTB融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。 相似文献
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K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序 总被引：1，自引：0，他引：1
利用重叠延伸PCR技术将K88ac STⅡ融合基因克隆于T载体上,将重组基因质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,通过PCR、NcoI/XcoI酶切后测序,与genbank报道的K88ac结构基因序列进行比对,证明所克隆的目的片段为K88ac STII融合基因。 相似文献
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大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础. 相似文献
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大肠杆菌不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
不耐热肠毒素LT是肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E．coli，ETEC）分泌的一种热不稳定性肠毒素，由A、B两种亚单位组成的AB5型杂六聚体蛋白，是目前人们发现的最强有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂之一。本研究利用基因工程技术，从强致病菌株K88ac中，分别克隆了LTA和LTB基因，并利用高效植物表达载体pBI121、pBLG和pCAMBIA2300成功构建了带有内质网滞留信号RDEL／KDEL不耐热肠毒素A、B哑单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA—LTB。为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。 相似文献
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[目的]为了建立用于细胞表面展示的载体系统。[方法]利用PCR技术,以大肠杆菌质粒为模板扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC~faeH,并克隆到pBR322质粒载体中。合成一段替换序列,在菌毛抗原基因的超变区引入酶切位点ApaI和NcoI,合成耐热肠度素STII表位编码序列,并引入菌毛抗原基因的超变区。[结果]经PCR鉴定和限制性内切酶酶切证明,重组质粒pBR-fae插入片断大小为6.6kb,与预期相符。核苷酸序列分析证明,所得faeC~faeH序列正确。PCR筛选和测序验证证明,构建了K88菌毛-耐热肠度素STII的融合基因。[结论]试验成功获得了重组质粒pBR-fae-ST。 相似文献
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为了克隆山羊β-酪蛋白基因的调控区并检测5′调控区的启动子活性,利用Long PCR技术对西农莎能奶山羊β-酪蛋白基因(CSN2)5′和3′调控区进行了克隆(5′调控区分两段进行克隆,3′调控区进行直接克隆)、测序,将克隆的5′调控区的两个片段通过共有的单一性酶切位点HindⅢ融合成一个长为6.7 kb的片段,用其替代表达载体pEGFP-C1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺上皮细胞中的瞬时表达。结果表明,克隆的GC 3.3、GC 4.3、GC 6.6 3个片段与GenBank中登录的山羊CSN2基因相应序列相比,同源性均为99%,其包含了TATA box、GC island、CAAT box、SAR、AP1、Oct-1、Sm、Glyco、Pu-1、CAC等复合元件和转录翻译调节因子的作用位点,并且5′调控区可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊CSN2基因5′调控区的有效性,表明克隆的调控区可用于乳腺生物反应器的研究。 相似文献
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根据获得的鮸鱼应激蛋白(stress-inducible protein I,STI1)基因的EST序列,克隆测序获得鮸鱼STI1基因的全长cDNA序列。鮸鱼STI1基因全长为2 194bp,包括5’非翻译区31bp,3’非翻译区634bp,开放阅读框1 629bp,编码542个氨基酸。根据氨基酸序列推测鮸鱼STI1分子中含有5个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个多聚脯氨酸识别位点,2个核定位信号识别位点,9个TPR结构域。对物种间STI1基因比对表明,鮸鱼存在保守的半胱氨酸位点,与其他物种STI1基因的相似性在76.5%～94.3%之间。用邻接法构建的STI1基因的系统发育树表明,硬骨鱼类的STI1基因形成独立的一支,其中鮸鱼与大黄鱼的STI1基因同源性最高。荧光定量PCR结果显示,鮸鱼STI1基因的mRNA主要分布于肌肉和肾脏中。 相似文献
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猪水肿病的主要毒力因子是志贺样毒素的2型突变体(Stx2e),毒素的A亚基是有毒的酶活性单位,B亚基无毒,介导毒素与受体的结合。为了增加B亚基的免疫原性,采用重叠PCR将猪源志贺样毒素Ⅱ型突变体B亚单位(Stx2e B)连接至热敏肠毒素的B亚单位(LTB)成熟肽N末端,获得Stx2e B与LTB相连的融合蛋白基因Stx2e B-LTB。融合基因克隆到表达载体pQE30中,在IPTG的诱导下,融合基因在大肠杆菌中获得表达,表达量占细菌总蛋白的8%。融合蛋白的获得为猪水肿病基因工程亚单位疫苗的制备、猪水肿病的预防奠定了基础。 相似文献
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金黄色葡萄球菌B型肠毒素的酶联免疫检测 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]为细菌毒素的检测提供理论依据。[方法]以BALB/c小白鼠为免疫对象,以自制的高纯度金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)为免疫抗原,研究其抗体的产生过程和效价,并建立SEB的间接竞争ELISA检测方法。[结果]自制SEB纯度较高,能较好地刺激动物产生抗体。以自制SEB为免疫抗原注射BALB/c小白鼠,其最高效价为1∶100 000。SEB浓度在1~1 000 ng/ml范围内,竞争抑制率与SEB浓度的对数值呈显著线性关系。当SEB的浓度为5~500 ng/ml时,随样品中SEB浓度的增加,污染样品的回收率变异系数减小,检测准确度提高。[结论]对不同污染程度的牛奶样品,利用间接竞争ELISA法检测其SEB残留的灵敏度远远高于生化法。 相似文献
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以产肠毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素(STa、STb)基因和不耐热肠毒素(LT)基因保守序列为靶序列,设计合成了3对可扩增目的片段为182、108和336 bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因和不耐热肠毒素基因的多重PCR方法.该方法对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌Streptcoccus、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimrium和猪肺疫巴氏杆菌Pasteurella pneumotropic的检测结果均为阴性,并且能检测到102cfu/mL稀释度的标准菌.对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果为:含STa基因的菌株为5株;含STb基因为2株;含LT基因为3株,其中2株同时具有STb和LT基因.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查. 相似文献
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通过流行病学及病原学的调查研究，从患黄痢的新生仔猪分离出13株O149大肠杆菌，采用兔肠结扎试验、平板免疫溶血试验对其产肠毒素性能进行了鉴定，生物学试验和血清学反应的结果表明，O149大肠菌株的被检滤液中存在热敏肠毒素（LT）。 相似文献
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为了使大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,通过PCR和重叠—延伸PCR扩增突变体LTK63/G192基因片段,IPTG诱导表达目的蛋白,经Western免疫印迹检测目的蛋白,在HPLC系统上纯化目的蛋白,经ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡。结果表明:制备的突变体LTK63/G192的基因片段经酶切和测序发现,所构建的表达载体pLTK63/G192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换;经SDS-PAGE电泳检测,野生型LT及双突变体均表达出约33.0ku和13.0ku的两条蛋白带,与LTA、LTB亚基分子质量相吻合;经Western bolt检测,两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应;双突变蛋白的酶活性和毒性与野生型LT相比酶活性和毒性都有所降低;突变体LTK63/G192能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高抗新城疫病毒的IgG和IgA。说明LTK63/G192是一个良好的免疫佐剂。 相似文献
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Dang Fang-fang Jiang Yu-jun Pan Rui-li Zhuang Ke-jin Wang Hui Sun Lu-hong Wang Rui Zhao Feng Li Tie-jing Man Chao-xin 《东北农业大学学报(英文版)》2018,(3)
Predictive microbiology was utilized to model Staphylococcus aureus(S. aureus) growth and staphylococcal enterotoxin A(SEA) production in milk in this study. The modified logistic model, modified Gompertz model and Baranyi model were applied to model growth data of S. aureus between 15℃ and 37℃. Model comparisons indicated that Baranyi model described the growth data more accurately than two others with a mean square error of 0.0129. Growth rates generated from Baranyi model matched the observed ones with a bias factor of 0.999 and an accuracy factor of 1.01, and fit a square root model with respect to temperature; other two modified models both overestimated the observed ones. SEA amount began to be detected when the cell number reached 10~(6.4) cfu · mL~(-1), and showed the linear correlation with time. Besides, the rate of SEA production fitted an exponential relationship as a function of temperature. Predictions based on the study could be applied to indicate possible growth of S. aureus and prevent the occurrence of staphylococcal food poisoning. 相似文献
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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。 相似文献