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1.
【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标,构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因,以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标,抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization,SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明,A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05）,而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较,26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性,2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源,为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。 相似文献
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为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。 相似文献
3.
【目的】筛选影响绵羊羊毛性状的重要候选基因,为研究羊毛性状形成的分子机制奠定基础。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建中国美利奴超细型和哈萨克羊兴盛期皮肤组织间正、反向消减cDNA文库,并对差异基因进行测序和生物信息学分析;应用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。【结果】①从所构建绵羊皮肤组织的正、反向消减cDNA文库中分别获得153和143个ESTs,其中分别包括5和4个未知功能的ESTs,推测可能是新基因;对部分已知功能ESTs进行了GO聚类分析、通路分析和蛋白互作分析,结果显示粗、细毛羊之间存在一定差异;②文库中的3个差异基因KRTAP8-2、Trichohyalin和KRTAP3-2均能在皮肤中特异性地高表达,其中KRTAP8-2和Trichohyalin基因在中国美利奴超细型羊皮肤组织中的表达丰度分别是哈萨克羊的3.45和2.07倍,而KRTAP3-2基因在哈萨克羊皮肤组织表达丰度是中国美利奴超细型羊的1.87倍。【结论】成功构建了中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织间抑制性消减cDNA文库,初步筛选出一批可能影响羊毛性状的差异表达ESTs。 相似文献
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福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。 相似文献
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绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。 相似文献
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利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因 总被引：13，自引：0，他引：13
为了筛选线虫的性别特异性基因，为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具，本研究选择猪蛔虫（Ascaris suum）为模型，分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后，采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交（SSH），构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库，并采用地高辛（DIG）标记的cDNA探针进行Southern 杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明，雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析，发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs，5个新的ESTs；25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs，还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建，为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。 相似文献
8.
利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)方法构建了中国草原红牛与中国荷斯坦牛背最长肌差异表达消减c DNA文库,共获得859个差异表达克隆,对全文库进行了测序并与Gen Bank数据库进行比对分析。结果表明:共获得789个新ESTs,84个未知功能蛋白基因,356个已知功能蛋白基因。在已知功能蛋白基因中,表达上调的基因有123个,表达下调的基因有233个。差异表达基因可能与肉质性状有关,可以作为肉质性状的候选基因进行深入研究。 相似文献
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抑制消减杂交技术筛选鹅产蛋期差异表达基因 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]鉴定筛选鹅产蛋与就巢差异表达基因。[方法]应用抑制消减杂交技术构建鹅产蛋与就巢鹅卵巢组织双向cDNA文库,获得差异表达基因。[结果]从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签（ESTs）。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经Blast比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。[结论]比较就巢与产蛋SSH文库,发现产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多,而在就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高。该结果对进一步研究鹅卵泡发育及繁殖力分子标记筛选打下了基础。 相似文献
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《云南农业大学学报(自然科学版)》2015,(5)
蜜蜂的蜂王和工蜂是两种不同的表型,这是基于基因的差异表达,而不是遗传物质的多态性。本研究以雌性东方蜜蜂为材料,利用抑制消减杂交技术构建东方蜜蜂蜂王和工蜂的基因差异表达的文库。挑选插入片段大于200 bp的330个阳性克隆进行测序,蜂王消减文库176个,工蜂消减文库154个。测序后蜂王消减文库获得161条ESTs序列,工蜂消减文库获得142条ESTs序列。获得的序列采用DNAstar seq Man软件进行载体、接头和低质量序列去除后进行ESTs分析,蜂王消减文库获得110个contings,工蜂消减文库获得81个contings,蜂王和工蜂文库均有部分重叠的ESTs序列。在NCBI上进行在线BLASTx和t BLASTn同源比较,发现在蜂王的ESTs中有62个已知ESTs,3个未知ESTs,工蜂的ESTs中有49个已知ESTs,8个未知ESTs。通过基因本体论进行功能分析,大部分差异表达的基因为酶类和结合蛋白,主要参与基因的转录、翻译和新陈代谢过程。雌性东方蜜蜂差减文库的构建,为进一步研究蜜蜂级型分化的机制奠定了基础。 相似文献
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中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。 相似文献
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通过对Cd2+胁迫下星星草抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库的分析,从正向和反向消减文库中筛选出33个特异表达的阳性克隆,26个镉胁迫诱导表达,7个为镉胁迫抑制表达。序列分析表明,有29个与数据库中有同源性,其中功能已知的25个,未知功能有4个,剩余4个为无同源序列的新基因。已知功能序列中,19个为胁迫后诱导表达,6个为胁迫后抑制表达,其中谷胱甘肽还原酶(GSR)基因、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)基因、细胞膜CP5蛋白基因和ABC家族蛋白基因等与星星草抗镉离子胁迫密切相关。 相似文献
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[目的]构建烟草打顶后根尖组织的消减文库,寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因.[方法]以打顶株为测验子(tester)、以非打顶株为驱赶子(driver),利用抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization,SSH)和反向Northern杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库,并对差异表达克隆进行生物信息学分析.[结果]构建了具有高消减效率的cDNA文库.PCR验证消减文库阳性克隆的插入片段为200-1 000 bp.经反向Northern杂交,从850个克隆中筛选到560个杂交信号差异明显的克隆,测序后得到273条有效序列.对273个已知功能基因的ESTs进行分类,生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转导和转录因子类占18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%,碳代谢占6%、其它代谢占15%,功能未知类占13%.RT-PCR结果显示,NTAT84和NTAT71序列在烟株打顶后转录活性均升高.[结论]应用SSH技术构建了烟草打顶前后根尖组织消减cDNA文库. 相似文献
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在植物的不同生长、发育、繁殖阶段和不同类型细胞中,基因的表达各不相同。近几年发展起来的研究基因差异表达的方法很多,抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization）是其中一项基于转录水平,结合消减杂交与 PCR技术的分离差异表达基因的方法,其原理可概括为消减同源序列,富集差异序列。该技术报道于1996年,在一个循环过程中分离差异表达基因尤其是低丰度表达的基因,虽然存在一些缺点,但以其较高的灵敏性、容易操作、假阳性率低、重复性好等优点,在分离及其克隆差异表达基因研究方面得到了广泛的应用。近几年,此技术在植物抗病基因的诱导表达方面已得到了应用,目前大多数研究主要集中在文库构建及筛选等方面。文章对抑制性消减杂交（SSH）技术的原理、优缺点及其在植物抗病性研究机制中应用进展进行了综述。 相似文献
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【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料,提取总RNA和mRNA,反转录合成cDNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交（SSH）,构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条,大小主要分布在350-1 200 bp之间;将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。 相似文献
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章卓 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2010,36(3):339-343
以致病性嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)人工感染的草鱼肠道组织为材料,采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织消减cDNA文库,对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得147个草鱼肠道表达序列标签(EST).序列同源性搜索结果表明,97个EST代表了46个已知基因,其余50个EST为未知序列.与细胞防御相关的EST有43个,分属13个基因. 相似文献
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目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。 相似文献
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为了从单卵泡水平建立非闭锁大小卵泡颗粒细胞基因表达的消减文库,选择繁殖性能正常、空怀高繁殖力黄淮山羊2只,以氯前列烯醇处理40h后取卵巢,计数卵泡并测量卵泡直径,钝性分离采集卵泡颗粒细胞,置于液氮内保存,取样后的卵泡部分组织采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行闭锁鉴定。选择直径6和4mm非闭锁卵泡,提取颗粒细胞mRNA,扩增cDNA,监测抑制消减杂交及其文库构建的试验环节。结果表明:消减文库的阳性克隆测序成功率100%,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,发现12个全新表达序列标签;应用RT-PCR对已知序列的抑制素βA亚基基因(INHBA)和谷胱甘肽S-转移酶A1基因(GSTA1)进行表达水平测定,证实了颗粒细胞2个基因mRNA的表达模式与差异显示的结果相同。表明消减文库构建成功。 相似文献
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为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础. 相似文献
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为克隆和研究淋球菌耐药相关基因，分别从耐药性淋球菌菌株RSM292C4和WHO标准参考淋球菌株WHO-A细胞中提取DNA，用RsaⅠ酶切成400-600bp的片段。将酶切耐药菌株基因DNA片段分别与不同的接头连接，再与标准参考菌株DNA进行消减杂交及抑制性PCR检测，将所得PCR产物与克隆载体连接，构建差异DNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，获得2500个克隆。随机挑取96个制备质粒进行PCR检测，均扩增出100-600bp大小的片段。耐药淋球菌差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆耐药淋球菌特异的未知新基因奠定了基础。 相似文献