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1.
银杏第1染色体DNA文库的构建 总被引：7，自引：1，他引：7
观察了50个银杏根尖的染色体,发现在约半数根尖中,最大的1对染色体(第1染色体)随体有差异,其中1条随体较大而明显,另1条则很小.采用玻璃针分离法,通过显微操作系统成功地分离了随体较为明显的那条第1染色体.将分离到的单条染色体去蛋白,Sau3A酶切,并在染色体DNA片段两端加上Sau3A人工接头,进行2轮PCR扩增,得到了大小为300-3000bp的扩增片段.用第2轮PCR产物构建质粒文库,得到了约含有75000个重组子的该染色体DNA文库.随机挑取66个重组子进行分析,发现插入片段大小主要分布在500-2000bp,平均为800bp.该文库为银杏第1染色体特异探针的筛选、遗传图谱的构建、重要基因的克隆以及性染色体的鉴别等研究提供了基础. 相似文献
2.
小麦-中间偃麦草二体异代换系山农0095的选育及其鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
利用小麦品种烟农15与中间偃麦草直接杂交，以烟农15为回交亲本对其杂种F1回交2次，再经自交3次，从BC2F4中选出种质系山农0095。利用形态学、细胞学、种子醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）、RAPD和GISH等方法对其进行鉴定。结果表明，山农0095平均株高78 cm，穗长17.3 cm，穗粒数74个，旗叶长36.3 cm，旗叶宽3.03 cm，茎秆粗壮，多花多实，繁茂性好；其根尖细胞染色体数目为2n＝42，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMC MⅠ)染色体构型为2ｎ=21Ⅱ；它与烟农15的杂种Ｆ1 在减数分裂中期Ⅰ的大多数花粉母细胞能观察到2个单价体，平均染色体构型为2ｎ=20.08Ⅱ＋1.84Ⅰ。A－PAGE鉴定结果表明，山农0095在β区出现一条中间偃麦草的特异带；从180个RAPD引物中筛选出一个特异引物S186（5?－GAT ACC TCGG－3?），能够在山农0095中扩增出一条约900 bp中间偃麦草的特异带，标记为S186900；以中间偃麦草基因组DNA为标记探针、中国春基因组DNA为封阻的原位杂交结果进一步表明，山农0095的42条染色体中含有2条完整的中间偃麦草染色体，是小麦－中间偃麦草的二体异代换系。 相似文献
3.
为进一步确定柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)端粒DNA的重复序列,为下一步端粒酶活性检测奠定基础,根据已克隆发表的E.tenella端粒DNA重复序列信息,设计了由4个端粒重复序列串联的寡聚核苷酸探针(TTTAGGG)4,并以生物素地高辛标记。将该探针与经BAL31-EcoRⅠ酶切后的E.tenella基因组DNA进行Southern印迹杂交分析。结果显示:E.tenella基因组DNA与探针杂交获得了清晰的杂交条带,随BAL31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱,进一步证明了E.tenella端粒DNA重复序列为5-′TTTAGGG-3′,且此重复序列在E.tenella染色体的末端。 相似文献
4.
【目的】利用基因组荧光原位杂交（genomic in situ hybridization,GISH）技术,对黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=2x=14）种内两个变种（栽培黄瓜C. sativus var. sativus和野生黄瓜C. sativus var hardwickii）进行中期染色体分析,建立黄瓜变种染色体核型的快速分析方法,为黄瓜细胞分子遗传学研究提供基础。【方法】以栽培黄瓜‘9930’和野生黄瓜C. sativus var. hardwickii为材料,利用CTAB法提取栽培黄瓜‘9930’的基因组总DNA,采用缺刻平移法,将栽培黄瓜‘9930’基因组DNA和45S rDNA分别利用地高辛和生物素标记为探针,与栽培黄瓜‘9930’和野生变种C.sativus var. hardwickii的中期染色体进行荧光原位杂交,根据杂交结果显示的栽培黄瓜与野生变种每条染色体GISH荧光带型的不同,结合45S rDNA位点信号特征,区分栽培黄瓜与野生变种的每条染色体,并进行核型分析。【结果】荧光原位杂交结果显示,GISH信号并非平均分布于所有染色体上,而是在不同染色体的特定部位产生独特的信号,且两个变种间中期染色体的GISH信号模式差异显著。在栽培黄瓜‘9930’有丝分裂中期染色体上,除了6号染色体仅在短臂末端和近着丝粒处产生GISH信号外,其他染色体上的GISH信号集中分布于染色体的两端和近着丝粒的一侧或两侧,且每条染色体的信号特征差异明显;45S rDNA信号主要分布于‘9930’的第1、2、3、4和7号染色体的近着丝粒处,有3对强信号和2对弱信号。在野生黄瓜C. sativus var. hardwickii有丝分裂中期染色体上,杂交信号的位置及强弱与栽培黄瓜‘9930’表现明显不同,近着丝粒处均有GISH信号,但仅在第1、2、4和5号染色体的一端产生GISH信号,45S rDNA信号仅出现在第1、2和3号染色体上,表现为第1号染色体上信号极强,第2和3号染色体上信号极微弱。这些结果显示,以栽培黄瓜基因组DNA为探针的荧光原位杂交能反应出两个变种中期染色体独特的信号分布模式,通过信号的分布模式和强弱,结合45S rDNA位点信号的特异分布,可对每条染色体进行清晰地鉴别,并据此建立了两个变种的核型模式。比较前人发表的黄瓜已有重复序列的分布图,发现GISH揭示的信号分布主要位于黄瓜染色体串联重复序列区域。【结论】黄瓜基因组原位杂交能一次性快速显示基因组串联重复序列的分布图,能有效地用于不同黄瓜变种的快速核型分析;同时发现染色体上串联重复序列的分布及强弱在黄瓜变种间表现出明显的分化。 相似文献
5.
水滴伪康纤虫为海水养殖鱼类的重要危害性寄生虫。采用SMART技术构建营养期水滴伪康纤虫全长cDNA文库,初始文库滴度3.3×106pfu·mL~(-1),文库容量约为1.5×107 pfu,重组率97%。随机挑取24个克隆,经PCR检测插入的片段长度在0.3~2.0kb,平均长度500bp。挑选文库中的1 200个克隆进行表达序列标签测序,得到1 032条高质量的EST,与NCBI数据库进行比对后,获得292个同源基因,其中包含190条单拷贝EST和102个重叠群,冗余度为71.7%。有215条EST在Tetrahymena thermophila,Paramecium tetraurelia,Ichthyophthirius multifiliis,Cryptocaryon irritans,Oxytricha trifallax等自由生活及寄生种类的纤毛虫的基因组中比对到同源基因,其中有134条EST具有功能注释,其余为未知功能的假定蛋白基因。水滴伪康纤虫cDNA文库的构建及EST测序的完成,为进一步发现和研究水滴伪康纤虫的功能基因奠定了基础。 相似文献
6.
琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。 相似文献
7.
地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针.分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应,与霍乱弧菌DNA则无反应,表明该外膜蛋白DNA探针的特异性较低.说明所构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法具有特异性强、简便易行,可应用于溶藻弧菌的快速检测. 相似文献
8.
基因组原位杂交中封阻DNA制备方法研究 总被引：3，自引：0，他引：3
在基因组原位杂交中,适当的封阻可以大大提高基因组原位杂交的效率。本研究采用煮沸法、超声波剪切法对大白菜基因组DNA进行剪切,研究了大白菜封阻DNA的制备方法。结果表明:珠沸法效率高,操作简单,当煮沸70 min DNA片段大小主要集中在200～500 bp,适于在基因组原位杂交中作为封阻。研究结果为基因组原位杂交的应用奠定了基础。 相似文献
9.
【目的】偃麦草(Thinopyrum)是小麦(Triticum aestivum L.)的多年生野生近缘植物,具有许多可用于小麦品种改良的优异基因。利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系、绘制染色体指纹图谱及检测外源染色质。克隆十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum(Host)Liu and Wang)基因组特异重复序列,可用于鉴定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质。【方法】通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库,并对文库进行高密度点杂交(Dot-blot hybridization)筛选,结合荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术,获得偃麦草基因组特异的重复序列,分析其在不同基因组及染色体上的分布特点。利用Repeat Masker在小麦族重复序列数据库(Triticeae repeat sequence database,TREP)及NCBI Gen Bank对特异重复序列进行比对分析,并设计偃麦草基因组特异重复序列的PCR引物。通过FISH分析和特异PCR引物扩增,对小麦-偃麦草衍生后代进行鉴定和选择。【结果】获得7条偃麦草基因组特异的重复序列。FISH分析表明,其在十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布,且在不加小麦封阻DNA的情况下,能明确区分八倍体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体。将其应用到小麦-偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中,特异重复序列同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段,而且信号相比基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)更加特异和清晰。基于偃麦草基因组特异重复序列开发了90对引物,通过在中国春、十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析,筛选出36对(40%)偃麦草基因组特异PCR标记;利用这些特异引物对109份小麦-偃麦草衍生材料进行扫描,发现10对扩增效果较好的特异引物,其检测效率为73.3%—95%。【结论】获得偃麦草基因组特异的重复序列,开发了特异PCR扩增引物,可应用于小麦背景下偃麦草遗传物质的高效检测和跟踪。 相似文献
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[目的]确定白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法.[方法]用TE、ES1、ES2 3种提取液及相应的方法提取叶片和愈伤组织总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测提取产物,通过普通PCR及荧光定量PCR检查DNA的可用性,并将PCR产物经克隆测序验证.[结果] ES1法提取的叶片和愈伤DNA条带清晰,纯度较高;普通PCR和荧光定量PCR可扩增出200和600bp左右的目的条带.ES2法提取液电泳不能检测到DNA条带,但PCR可扩增出愈伤组织200bp左右目的条带.TE法得到的提取液检测不到DNA条带且PCR不能得到目的条带.[结论] ES1提取液及相应的提取方法可用于白木香愈伤和叶片DNA高通量快速提取,为沉香属植物种质研究和分子研究奠定基础. 相似文献
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中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529 bp重复序列的变异进行研究，从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后，用PCR方法对10个虫株的529 bp重复序列进行扩增；扩增产物经纯化后克隆于pGEM-T Easy质粒载体，再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆，然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529 bp重复序列都不完全相同，它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529 bp重复序列可作为遗传标记，用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定，但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。 相似文献
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[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础. 相似文献
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福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。 相似文献
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RT-PCR和Digoxigenin标记的核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒试验研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一ＩＢＶＨ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ，分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０ｂｐ，２２８ｂｐ，６０２ｂｐ，的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０，Ｈ５２，Ｍ４１，Ｃｏｎｎ，Ｇｒａｙ，Ｔ，Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒，上毒，云毒，ＨＫ，１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ。结果除Ｈｏｌｔｅ株，２个分离株（宜毒，云毒）外，其余均被成功地扩增出６０２ｂｐ的片段。将ＩＢＶＨ１２０株０６ｋｂＰＣＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记为探针，分别与上述各ＩＢＶ毒株的核酸及其扩增产物进行核酸杂交，均呈现阳性反应，而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＤＮＡ，ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液抽提物反应。ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交技术提供了直接从尿囊液中快速检测出病毒，作为诊断ＩＢＶ的新方法。 相似文献
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以浙江近海三疣梭子蟹大螯肌肉的线粒体DNA作为模板,对4群体共67个个体的控制区（D-loop）序列进行了PCR扩增。通过对PCR产物进行双向测序,最终得到了控制区3’端的rRNA部分序列（64 bp）、D-loop全序列（1179 bp）及控制区5’端tRNA-Ile部分序列（73 bp）。经DNASP软件分析得知,67个D-loop序列定义了65个单倍型,在65个单倍型中,除去插入/缺失位点,所有单倍型共检测到344个多态位点,主要发生在D-loop序列的中间区域;D-loop序列检测到26个插入或缺失位点,碱基插入主要发生在中央后端区域,以13 bp重复片断插入的形式进行。每个个体含有0～3个连续重复片断。通过对三疣梭子蟹的遗传多样性分析发现,D-loop序列的单倍型多样性为0.982～1.000,核苷酸多样性指数为0.02770～0.03633,平均核苷酸差异数为31.790～43.304。综合分析,三个成蟹群体的遗传多样性相近,都低于仔蟹的遗传多样性,说明经过遗传育种,可以提高三疣梭子蟹的种质情况,真正实现对三疣梭子蟹的科学利用。 相似文献
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东乡野生稻重复序列的克隆分析及染色体定位 总被引：3，自引：0，他引：3
从东乡野生稻(O ry za ruf ipogon G riff)中克隆到7个重复序列,序列分析表明:这些序列是与转座因子有关的序列。以序列H 2为探针,对不同基因组水稻进行Southern杂交,表明该序列为稻属内AA基因组特异的重复序列。其分布在水稻的多条染色体上,荧光原位杂交(F ISH)结果显示该重复序列主要位于染色体的着丝粒以及端粒附近,重复单位序列长度为615 bp左右。并就特异重复序列在水稻研究中的应用进行了讨论。 相似文献
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尼罗罗非鱼Sox基因PCR—SSCP分析 总被引：4，自引：0，他引：4
参照人SRY基因HMG—box保守区序列,设计1对兼并引物,采用PCR技术扩增了尼罗罗非鱼Sox基因,在雌、雄尼罗罗非鱼个体中均扩增出5条带,大小分别约为200、400、600、800、1200bp,回收200bp左右扩增产物进行克隆,阳性克隆采用SSCP分析,筛选不同基因片段。进一步对筛选的不同基因进行测序,结果获得了5个不同的228bpSox基因,与Gen-Bank联机．采用BLAST方法与人类相应SOX基因进行序列比对,发现其与人类相应SOX蛋白的氨基酸序列一致性分别为97．2％、97．2％、94．4％、96％、88．2％,显示出这些基因在分子进化上具有高度的保守性。 相似文献
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为研究杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的形成机制,探寻其产业化生产的有效途径,通过对GISH的多项试验参数进行优化,建立杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系,并对天然四倍体泥鳅(4n=100)与大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus(2n=48)正、反杂交后代进行GISH分析。结果表明:杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系中,探针DNA在温度为105℃、持续时间为2 min时,片段化后探针DNA片段长度为500~1000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为100~500bp;标记后的探针DNA与片段化后的封阻DNA混合比(P/B)在1∶25和1∶50时均可以得到较好的杂交信号;以大鳞副泥鳅全基因组DNA为探针DNA、天然四倍体泥鳅全基因组DNA为封阻DNA,与二者正、反交后代进行基因组原位杂交试验,结果显示,来源于亲本大鳞副泥鳅24条染色体在着丝点处均有杂交信号,无杂交信号染色体50条,来源于亲本泥鳅。该研究结果不仅为杂交三倍体泥鳅后代的鉴定提供了最直观的证据,也为中国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体并能产生2n的配子提供了分子细胞遗传学基础数据,对泥鳅三倍体育种研究具有一定的指导意义。 相似文献