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1.
为获得多浪羊IFN-γ地高辛探针,并对其标记效率进行检测。将多浪羊pMD-18T-IFN-γ克隆菌进行PCR扩增,经切胶回收及目的基因浓缩后获得目的基因IFN-γ,然后用地高辛标记和检测试剂盒对IFN-γ基因进行标记,获得IFN-γ地高辛探针。IFN-γ的PCR扩增产物经8g/L琼脂糖电泳分离后转移至Hybond N+膜,膜上显影后进行敏感性检测并计算探针质量浓度,结果显示,IFN-γ地高辛探针在杂交液中的质量浓度为30μg/L。Southern杂交显示,Hybond N+膜上有IFN-γ基因的双链DNA,且浓缩后的DNA(2.5μg)标记的特异性探针质量浓度较高,可以在Hybond N+膜上呈现出清晰的杂交条带,证明获得的探针质量浓度符合要求。 相似文献
2.
[目的]进行多浪羊IL-1β基因的克隆及序列分析,为多浪羊IL-1β的功能研究及多浪羊免疫应答基因的筛选奠定基础.[方法]根据GenBank中NM_001009465.2的mRNA序列设计引物,以新疆多浪羊淋巴细胞的总RNA为模板,用RT-PCR扩增多浪羊IL-1β基因序列.[结果]IL-1β基因序列包含了一个862 bp的开放阅读框,成熟蛋白编码的氨基酸序列长度为286个氨基酸.通过IL-1-β核苷酸多序列比对发现,第70、163、180、269位上四个相对保守的碱基处出现了四个突变;通过IL-1-β氨基酸多序列比对,第24、36位上两个氨基酸发生突变.通过G enBank中的Blastn序列比较分析,多浪羊的IL-1β基因与普通绵羊的同源性高达99;.[结论]在进化树体系中,多浪羊与反刍动物集成一束,它们与其它哺乳动物源于共同的祖先,但分别处于进化树上不同的分支. 相似文献
3.
[目的]为核酸杂交试验提供依据.[方法]利用3个不同长度的核酸探针进行3'末端地高辛标记,并对标记效率进行检测,研究探针的长度和浓度及其在尼龙膜上的固定方法对其信号强度的影响.[结果]聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明地高辛标记的探针比未标记探针滞后,说明标记较为成功.检测信号强度随探针摩尔浓度的降低而降低.探针的固定方法对信号强度也有一定的影响.紫外交联和高温烘烤均能使检测信号增强,而使用紫外交联的信号强度较高.[结论]地高辛检测的信号强度与探针的长度、浓度、固定方法以及核酸与膜的结合效率有关. 相似文献
4.
[目的]以骨形态发生蛋白受体(BMPR-IB)基因作为多浪羊的高繁殖力候选基因,研究该基因对多浪羊产羔性状的影响.[方法]采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术检测多浪羊BMPR-IB基因的单核苷酸多态性;用最小二乘法分析不同基因型与产羔数的相关性;并对基因型纯合个体进行测序.[结果]BMPR-IB基因在多浪羊中存在三种基因型即野生型++、突变杂合型B+和突变纯合型BB;基因型频率分别为0.741、0.254和0.005;B和+等位基因频率分别为0.132和0.868.BB基因型与++基因型相比在BMPR-IB基因编码区第746位碱基处发生了和Booroola绵羊相同的突变(A→G).B+基因型的平均产羔数比++基因型多0.51只(P<0.01),差异极显著.[结论]BMPR-IB基因是影响多浪羊多胎性状的一个主效基因,可作为一个分子标记用于多浪羊的选育. 相似文献
5.
[目的]为核酸杂交试验提供依据。[方法]利用3个不同长度的核酸探针进行3′末端地高辛标记,并对标记效率进行检测,研究探针的长度和浓度及其在尼龙膜上的固定方法对其信号强度的影响。[结果]聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明地高辛标记的探针比未标记探针滞后,说明标记较为成功。检测信号强度随探针摩尔浓度的降低而降低。探针的固定方法对信号强度也有一定的影响。紫外交联和高温烘烤均能使检测信号增强,而使用紫外交联的信号强度较高。[结论]地高辛检测的信号强度与探针的长度、浓度、固定方法以及核酸与膜的结合效率有关。 相似文献
6.
[目的]研究促卵泡素β亚基(follicle - stimulating hormone β,FSHβ)基因在多浪羊群体中的单核苷酸多态性,并检测该基因对多浪羊繁殖力的影响.[方法]采用PCR - SSCP技术,采集产双羔及以上的多胎多浪羊血样310份,研究FSHβ基因在多浪羊群体中的多态性,同时检测基因型频率以及等位基因频率.[结果]FSHβ基因在多浪羊群体中检测到AA、AB和BB三种基因型;基因型频率分别为0.36、0.6和0.04.多浪羊A和B等位基因频率为0.66和0.34.BB型与AA型相比有6处核苷酸发生了突变,该突变导致5个氨基酸的改变.BB基因型多浪羊产羔数分别比AB和AA基因型多1.1071只(P＜0.01)和1.017只(P＜0.01),AB与AA基因型之间的产羔数差异不显著(P＞ 0.05).[结论]FSHβ基因首次在新疆多浪羊群体中发现了BB基因型,绵羊FSHβ基因座位可能与多浪羊高繁殖力相关. 相似文献
7.
[目的]寻找与绵羊多胎性状相关的DNA标记,为提高绵羊繁殖力的标记辅助选择提供科学依据.[方法]试验以策勒黑羊为主要研究对象,利用PCR-RFLP、DNA测序等技术,对BMPR-IB、MTNRlA和PTGS2基因的遗传多态性进行研究.[结果]策勒黑羊BMPR-IB基因具有多态性,存在三种基因型:++、B+和BB;MTNR1A和PTGS2基因不存在多态.[结论]验证了BMPR-IB基因的A746G突变位点是策勒黑羊多胎性的主效基因,而MTNR1A和PTGS2基因与策勒黑羊繁殖性能关系不大. 相似文献
8.
[目的]比较小尾寒羊及其不同杂交组合后代在繁殖性能方面的差异,以期为寻找一种较理想的杂交组合提供前期基础和科学依据.[方法]试验以小尾寒羊自繁群HH及其3个杂交F1代群体(小尾寒羊×多浪羊(HDL)、小尾寒羊×萨福克(HS)、小尾寒羊×德国美利奴(HDM))为研究对象,对不同绵羊群体中FecB基因进行多态性检测,分析其遗传结构.[结果]在HH、HDL群体中存在三种基因型BB、B+、++,在HDM和HS群体中存在两种基因型B+、++,表明杂交群体HDM和HS已成功引入多胎基因FecB.[结论]以小尾寒羊作为母本,对于改善杂交子代的繁殖性能具有积极作用. 相似文献
9.
[目的]为了探明阿魏酸的抗炎机制.[方法]采用组织块培养法获得奶牛子宫内膜上皮细胞.用噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力.采用荧光定量PCR方法,分别对对照组、模型组、药物作用高、中、低剂量组在LPS作用3h、6h炎症基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA变化进行检测.[结果]阿魏酸在一定浓度范围内对细胞增殖无显著影响.药物预处理细胞能够显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达.[结论]阿魏酸能够显著降低LPS刺激细胞后炎症细胞因子的表达,说明阿魏酸是通过抑制炎症因子的表达发挥其抗炎作用. 相似文献
10.
地高辛随机引物法标记探针的Southern杂交技术优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为检测转基因抗虫棉中的Bt Cry1A基因的表达,采用地高辛随机引物法标记探针、化学发光检测的Southern杂交技术,通过纯化探针、使用最适探针浓度、优化真空转印、杂交及免疫检测方法等一系列优化过程,最终得到背景低、信号强的Southern杂交结果。 相似文献
11.
[目的]研究绵羊品种间免疫力或抗病力的差异,为开展绵羊抗病育种提供基础.[方法]以引进品种萨福克羊、培育品系多胎萨福克羊、地方品种哈萨克羊以及多胎萨福克羊和哈萨克羊杂交F1羔羊为实验对象,应用ELISA方法检测绵羊外周血部分免疫指标,分析绵羊品种间免疫指标差异并作相关分析.[结果]绵羊外周血中IFN-α、IFN-γ、IgG、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12含量之间存在正相关,外周血中MHC含量不是免疫力的间接指标.萨福克羊外周血中IFN-α、WBC、IgG、IL-5和IL-10含量显著低于哈萨克羊和萨哈F1羔羊(P＜0.05),IFN-α和WBC显著低于多胎萨福克羊(P＜0.05),萨哈F1的外周血中免疫指标最高.[结论]免疫指标也具有杂种优势的特点,引进品种萨福克羊的一般抗病力较弱,哈萨克羊是开展抗病育种的重要种质资源之一. 相似文献
12.
【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究 总被引：7，自引：0，他引：7
建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。对探针长度、浓度、总DNA含量、标记方法以及灵敏度等条件进行了研究。结果表明,用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40～50mer、40μmol·L-1)杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因;不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性差异(P<0.01),而不同浓度的探针之间没有显著性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3h;检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg;标记产物杂 相似文献
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[目的]探讨山豆根多糖(SSP)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子水平的影响,为研发出治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型兽药提供参考依据.[方法]以50、100、200和400 μg/mL SSP作用于PRRSV体外感染8h的RAW264.7细胞,通过MTT法评价SSP对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率,ELISA检测SSP对PRRSV体外感染RAW264.7细胞培养上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1.[结果]PRRSV感染RAW264.7细胞8h极显著降低了细胞存活率(P<0.01,下同),而200~400 μg/mL SSP能极显著升高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率.PRRSV感染RAW264.7细胞8h可极显著升高细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平,而SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌上述炎性因子水平,其中以200~400μg/mL SSP的抑制效果最佳.[结论]SSP通过提高炎症细胞存活率及抑制其分泌炎性因子水平,从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应. 相似文献
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[目的]探索检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[方法]利用CTAB法提取感病苹果叶片总RNA,以总RNA为模板,利用特异性引物,建立利用cDNA探针检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[结果]扩增出了预期片段,经克隆、测序证明该片段为苹果褪绿叶斑病毒的特异性片段。以带有特异片段的质粒为模板,利用PER技术制备出地高辛标记的cDNA探针。[结论]以质粒为模板可高效制备大量探针。地高辛标记探针为非放射性标记探针,安全性较好,灵敏度较高,具有重要的应用价值。 相似文献
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[目的]探讨多浪羊和卡拉库尔羊卵巢组织中FSHR基因表达变化规律.[方法]采用免疫组织化学SP方法对两种绵羊卵巢组织上FSHR进行定位研究.[结果]FSHR阳性细胞主要表达在颗粒细胞上,在卵母细胞和膜细胞上也有少量表达,两地方品种绵羊卵巢上原始卵泡和闭锁卵泡时期表达差异不显著(P＞0.05),而在初级卵泡、次级卵泡时期和成熟卵泡上表达差异显著(P＜0.05);对同种绵羊分析时又发现原始卵泡与其他卵泡之间FSHR阳性细胞表达差异显著(P＜0.05),成熟卵泡时期阳性细胞表达显著(P＜0.05)高于初级和次级卵泡.闭锁卵泡是阳性细胞率与其他各级卵泡差异极显著(P＜0.01).[结论]推测出多浪羊对FSH的敏感性高于卡拉库尔羊,表明FSHR含量越高繁殖率越高.FSHR可能也参与其他因子的调控. 相似文献
20.
《南京农业大学学报》2020,(1)
[目的]本试验旨在探究乳腺炎奶牛乳腺组织中是否存在细胞程序性坏死。[方法]采集健康和乳腺炎奶牛乳腺组织,HE染色后进行形态学观察,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测炎性相关因子基因(IL-1β、IL-6、TNF-α)和程序性坏死相关因子受体相互作用蛋白基因(RIPK3、RIPK1)、混合谱系激酶结构域样蛋白基因(MLKL)和Caspase8基因表达,Western blot检测MLKL和磷酸化MLKL蛋白(p-MLKL)表达。[结果]程序性坏死标记蛋白MLKL在乳腺炎乳腺组织中表达;IL-1β、IL-6、TNF-α和RIPK1 mRNA的表达量极显著升高(P0.001),RIPK3 mRNA表达量显著升高(P0.01),Caspase8 mRNA表达量极显著降低(P0.001);MLKL mRNA和蛋白表达量差异均不显著(P0.05),但p-MLKL蛋白表达量显著增加(P0.05)。[结论]根据程序性坏死相关因子的表达变化,可以推断出在乳腺炎乳腺组织中存在细胞程序性坏死。 相似文献