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文章采用基因定点突变和报告基因技术作A/T富集区启动子鉴定和转录调控分析,研究鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区是否具有启动子活性。PromPredict预测分析提示miR-17-92基因簇上游-388～-444 bp处可能是启动子区域。转录因子结合位点分析发现,A/T富集区存在3个E2F1潜在结合位点,分别位于miR-17-92基因簇上游-1 273 bp(结合位点1)、-1 186 bp(结合位点2)和-753 bp(结合位点3)处。报告基因活性分析发现,鸡miR-17-92基因簇上游A/T富集区具有启动子活性,其中miR-17-92基因簇上游-440/-1区域启动子活性最强。共转染分析显示,转录因子E2F1极显著抑制该A/T富集区启动子活性(P<0.01);进一步定点突变分析表明E2F1通过E2F1结合位点1和2抑制A/T富集区启动子活性。报告基因分析发现,与对A/T富集区启动子作用不同,E2F1促进miR-17-92基因簇宿主基因(MIR17HG)启动子活性。文章首次发现鸡miR-17-92基因簇上游存在一个新的转录调控区,对揭示鸡miR-17-92基因簇转录调控具有重要意义。 相似文献
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基于Golden Gate载体构建过程,对CRISPR/Cas9双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化,建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法。在本方法中,只需将设计好的2个靶点DNA小片段和1个外源片段用T4DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可。用本方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体,阳性率为100%,测序结果显示无突变。该载体系统非常适合大批量CRISPR/Cas9载体的构建,同时也为其他植物中构建双靶点CRISPR/Cas9载体提供借鉴。 相似文献
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为了阐明microRNA对猪产仔数的调节机制,采用CRISPR/Cas9技术构建针对猪miR-136的基因编辑表达载体。通过实验,在miR-136基因成熟区及其下游设计两个单链引导RNA(sgRNA),合成4条磷酸化的单链DNA寡核苷酸,复性后形成两条带粘性末端的双链寡核苷酸片段,插入线性化的载体pX462的BpiI酶切位点处,转化感受态大肠杆菌DH5α,经测序确认,得到两个编辑表达载体pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。构建了两个编辑miR-136基因的表达载体,为猪繁殖力的调控研究奠定了技术基础。 相似文献
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猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。 相似文献
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为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。 相似文献
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【目的】以调控茶树炭疽病菌(Colletotrichum camelliae)中的植物真菌毒素(Solanapyrones)合成的CcSOL4为例，构建CRISPR-Cas9的基因敲除载体系统，为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶炭疽菌中的应用奠定基础。【方法】通过对转录因子CcSOL4的基因序列分析，选择5个靶点以PCBC载体为模板扩增目的片段，再与表达载体PKSE401发生重组构建基因标记载体。以携带Cas9编码基因的PKSE401双元双靶点载体系统为骨架，以PCBC载体为模板扩增相应的sgRNA,运用Overlapping PCR以及Golden Gate Cloning技术构建针对炭疽病的双靶点和三靶点CRISPR/Cas9编辑载体。【结果】双靶点载体片段及三靶点载体片段扩增后大小为650～750 bp,将上述PCR片段连入载体PKSE401,双靶点载体1Sol4和2Sol4经阳性鉴定得到650 bp片段，三靶点载体3Sol4经阳性鉴定后得到1 200 bp的片段。【结论】重组载体构建成功，并建立了茶炭疽菌C.camelliae的CRISPR/Cas9敲除体系。 相似文献
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【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选"低毒、高硫"山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。 相似文献
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根据已知的番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)CCD7和CCD8基因的序列设计特异性引物,采用RT-PCR克隆CCD7和CCD8基因片段,通过特定酶切将2个基因进行拼接,再将串联基因以反向重复的方式连入p UCCRNAi载体,并定向插入到p35植物表达载体上。结果表明,克隆获得了大小约为400 bp的CCD7和CCD8基因片段,基因片段拼接后获得800 bp左右的串联片段CCD7-8;将该基因片段插入p UCCRNAi载体后得到1 700 bp大小的含Intron的反向重复序列In-7-8,并成功插入到植物表达载体p35中,通过酶切分析,RNAi载体构建正确。最终成功构建了番茄CCD7和CCD8 2个串联基因的RNA沉默表达载体p35-In-7-8。 相似文献
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[目的]利用高效基因编辑系统(pHDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础.[方法]设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增pCBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切pHDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞.提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体.[结果]重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致.成功构建了巨桉CTX基因家族pHDE-CTXA、pHDE-CTXB和pHDE-CTXC同源表达载体.[结论]利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴. 相似文献
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为研究生长期和休止期lnc15479的差异表达在陕北白绒山羊毛囊周期性发育中的作用及功能,利用CRISPR/Cas9技术,在lnc15479的上、下游各设计1个sgRNA靶位点,构建CRISPR/cas9表达载体;并基于SSA修复机制,分别构建含有红色和绿色荧光标记的双荧光报告载体系统。通过将表达载体和报告载体共同转染HEK293T细胞,检测该CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明,lnc15479的CRISPR/Cas9表达载体成功构建,根据红色和绿色荧光表达情况及细胞计数的方法,该系统的工作效率约为20%。研究结果为进一步分析lnc15479的功能提供技术支持。 相似文献
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利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点,通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sgRNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。 相似文献
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【目的】探究同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白基因（hLF）打靶山羊β-乳球蛋白基因（BLG）座位点效率的影响,为今后体细胞核移植制备BLG -/hLF +基因打靶山羊提供科学依据,也为CRISPR/Cas9基因编辑系统介导BLG基因或其他基因座位点定向精准分子修饰的遗传育种提供借鉴。【方法】针对山羊BLG基因第一外显子区域设计构建sgBLG/Cas9载体,电转染山羊胎儿成纤维细胞,PCR验证BLG基因座位点致突变活性;以BLC14乳腺特异性表达载体为基础构建3种同源臂长度（6.0、3.5和1.2 kb）的hLF基因打靶载体,分别与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经500 μg/mL G418筛选后,采用PCR检测基因打靶情况。【结果】sgBLG/Cas9载体在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座附近切割DNA双链的致突变活性效率在30%~35%。构建获得3种同源臂长度的hLF基因打靶载体（BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3）,对应的同源臂长度分别为6.0、3.5和1.2 kb;将3种hLF基因打靶载体与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经5次电转染和G418筛选,分别获得83、77和86株药物抗性细胞,经PCR同源重组检测最终获得42、38和44株BLG -/hLF +基因打靶细胞株,即hLF基因在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座的平均打靶效率分别为50.6%（42/83）、49.4%（38/77）和51.2%（44/86）。3种不同长度同源臂构建的hLF基因打靶载体在山羊BLG基因座位点的打靶效率在统计学上无显著差异（P>0.05）,表明同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊BLG基因座位点无显著影响。【结论】利用CRISPR/Cas9系统介导hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座位点能成功获得多株hLF +/BLG -基因打靶细胞株（BLG基因座定点打靶hLF基因）,但打靶载体同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导BLG位点定向整合hLF基因的打靶效率无明显影响。 相似文献
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干酪乳杆菌CRISPR基因座分析 总被引：1，自引：0，他引：1
目的 目前基于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9为核心的CRISPR/Cas9基因编辑系统在乳酸菌上的应用受到很多限制,亟待开发适合于乳酸菌的基因编辑系统。对6株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的CRISPR系统进行深入分析,并预测激活干酪乳杆菌自身Cas9蛋白所识别的PAM序列,为开发适用于乳酸菌的CRISPR/lcCas9基因编辑系统奠定基础。方法 以已完成全基因组测序的6株干酪乳杆菌为研究对象,利用生物信息学方法对其CRISPR系统进行深入分析,重点对不同菌株的CRISPR系统结构进行解析,并且对Cas蛋白以及spacer的同源性进行分析,最后对CRISPR区重复序列的二级结构以及Cas9蛋白识别的PAM序列进行预测。结果 6株干酪乳杆菌CRISPR系统具有相似的结构,均具有特征性的Cas9蛋白,并且Cas基因序列保守。预测到tracrRNA位于Cas9和Cas1之间,重复序列可以形成茎部长达7个碱基的二级结构。根据CRISPR的间隔区序列,6株干酪乳杆菌可被分为3个基因型,将间隔区逐一进行blast比对,结果表明6个间隔区比对上14个来源不同的原间隔序列,这些间隔序列均来源于不同质粒。干酪乳杆菌lcCas9蛋白识别PAM序列的1、3位碱基偏好T/C、A/C,2、4位碱基对G、A的偏好性比较大。结论 6株干酪乳杆菌CRISPR系统均为type-ⅡA型,Cas序列和重复序列高度保守。DR序列可以形成稳定的二级结构,TGMA为干酪乳杆菌Cas9蛋白高效识别的PAM序列。 相似文献
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【目的】通过CRISPR/Cas9系统对Y染色体多位点切割,实现目标染色体的敲除,为畜禽性别控制提供新的手段。【方法】以CRISPR/Cas9技术为基础,寻找Y染色体上能被sgRNA特异性识别的多拷贝重复序列,并通过体外切割、定量分析、核型鉴定验证其对靶点的有效性。【结果】所设计的sgRNA能够在体外实现对靶片段的明显切割,且切割效率均达到了50%以上。基因的定量分析结果证明了其在细胞水平切割的有效性,且簇状重复序列切割效果明显优于散在重复序列;核型鉴定结果证实了细胞水平猪Y染色体的丢失。【结论】研究结果为后续构建染色体敲除猪,实现猪的性别控制奠定了基础。 相似文献
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【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。 相似文献
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【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。 相似文献
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【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。 相似文献