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1.
将猪白介素18(Porcine interleukin18,PIL-18)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建了重组表达质粒pEGFP-PIL-18,利用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR检测技术确定目的蛋白的表达情况.结果在转染重组质粒24 h4、8 h后的BHK细胞中均观察到绿色荧光,转染的BHK细胞经G418筛选14 d后,用RT-PCR法检测目的基因,并扩增到长576 bpd的目的cDNA片段。表明在BHK细胞中成功地表达了PIL-18与EGFP的融合蛋白,这为下一步建立稳定表达PIL-18的细胞系奠定了基础. 相似文献
2.
鸡新城疫病毒(NDV)HN蛋白基因核酸疫苗的构建与血凝活性测定 总被引：3，自引：0，他引：3
将NDV弱毒株长春株表面糖蛋白HNcc基因和强毒株四平株HNsp分别插入到核酸疫苗质粒pIRES1中 ,置于CMV启动子的调控之下 ,构建成核酸疫苗表达质粒pIRHNC 及pIRHNS。经酶切鉴定插入正确后 ,用脂质体法转染BHK细胞 ,并于转染后 2 4h、4 8h、72h和 96h收获细胞 ,同时用G4 18进行筛选 ,待筛选细胞长成单层后收获一次细胞。取细胞裂解液检测其血凝活性。通过血凝试验表明两核酸疫苗质粒中的HN蛋白基因均获得表达并具有类似与天然蛋白的蛋白活性 ,且G4 18筛选后表达量高于筛选前的表达量 ,HNC活性略高于HNS。 相似文献
3.
鸡新城疫病毒（NDV）HN蛋白基因核酸疫苗的构建与血凝活怀测定 总被引：1，自引：0，他引：1
将NDV弱毒株长春株表面糖蛋白HNcc基因和强毒株四平株HNsp分别插入到核酸疫苗质粒pIRES1中，置于CMV启动子的调控之下，构建成核酸疫苗表达质粒pIRHN及pIRHNs。经酶切鉴定插入正确后，用脂质体法转染BHK细胞，并于转染后24h,48h,72h和96h收获细胞，同时用G418进行筛选，待筛选细胞长成单层后收获一次细胞。取细胞裂解液检测其血凝活性。通过血凝试验表明两核酸疫苗质粒中的HN蛋白基因均获得表达并具有类似与天然蛋白的蛋白活性，且G418筛选后表达量高于筛选的表达量，HNC活性略高于HN。 相似文献
4.
牛myf6基因真核表达载体的构建及在成肌细胞中的表达 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建牛myf6基因真核表达载体,并观察myf6真核表达载体转染鲁西黄牛成肌细胞后基因的表达和细胞形态的变化。【方法】在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入myf6基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞,通过G418 筛选出稳定转染的细胞株。利用Western印记、Real-time PCR技术检测成肌细胞转染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的表达量。【结果】与对照组相比,转染质粒的成肌细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高（P＜0.01）,肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量提高（P＜0.01）。细胞形态观察显示成肌细胞融合为肌管。【结论】构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6能在成肌细胞中高效表达,myf6基因促进了成肌细胞向肌肉细胞分化。 相似文献
5.
【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用Bgl Ⅱ和Hin d Ⅲ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示：（1）细胞形态（长梭形）、细胞生长曲线（呈S形）、群体倍增时间（随培养时间增加逐渐缩短）和细胞接种率（细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%）等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;（2）阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;（3）PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。 相似文献
6.
目的：研究表皮生长因子受体(EGFR)在妊娠滋养细胞疾病的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化方法，检测石蜡包埋的l05例妊娠滋养细胞疾病和20例正常早孕绒毛组织EGFR蛋白表达水平。结果：EGFR蛋白在妊娠滋养细胞疾病和正常早孕绒毛中均有不同程度的表达，在合体滋养层中，妊娠滋养细胞疾病和正常早孕绒毛组织均强烈表达EGFR蛋白，它们之间的表达差异无显著性。在细胞滋养层，正常早孕绒毛EGFR蛋白表达显著高于葡萄胎(P＜0．01)，葡萄胎EGFR蛋白表达显著高于侵蚀性葡萄胎和绒癌(P＜0．01)，EGFR蛋白表达在侵蚀性葡萄胎和绒癌之间差异无显著性(P＞0．05)。EGFR蛋白表达水平与滋养细胞肿瘤临床指标无关。结论：EGFR表达降低反映了在妊娠滋养细胞疾病发生发展过程中EGFR起重要作用。 相似文献
7.
RNA干扰南美白对虾白斑病毒VP28基因的体外研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为方便筛选VP28特异性siRNAs,通过构建真核表达载体pEGFP-VP28,然后将设计的siRNA与pEGFP-VP28共转染BHK细胞,并采用Western blotting检测GFP-VP28融合蛋白的表达情况以及半定量RT-PCR检验siRNA抑制VP28转录的效果,建立了体外RNA干扰法筛选系统。结果表明,pEGFP-VP28能在BHK细胞正常表达,设计的3对siRNA对VP28的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,其中siRNA2的干扰效果最为显著。研究结论为开展RNA干扰在对虾体内抑制WSSV的研究建立基础。 相似文献
8.
根据GenBank中登录的T7RNA聚合酶基因参考序列,设计合成了1对特异性引物扩增对T7RNA聚合酶基因进行扩增,将测序正确的T7RNA聚合酶基因和真核表达载体pIRES2-EGFP双酶切后进行连接构建pIRES2-EGFP-T7RNA RNA质粒。再将构建正确的pIRES2-EGFP-T7RNA质粒经用脂质体法转染猪睾丸细胞,通过G418筛选和单细胞克隆化,同时构建pET-32a-RED原核表达质粒载体,用其检测T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达。结果表明,建立的ST/T7RNA细胞系经20次传代仍然能稳定表达T7RNA聚合酶。结果显示,成功建立能稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系,为猪瘟病毒反向遗传操作平台奠定了基础。 相似文献
9.
猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]构建猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病的二联核酸疫苗并研究其免疫效果。[方法]将辽宁某猪场发病猪病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES-neo的CMV启动子下游,然后用猪2型圆环病毒（PCV-2）的内蒙古分离株的ORF2基因替换pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过W estern blot和IFA方法检测构建的重组质粒在BHK细胞中的表达情况。将重组质粒免疫Balb/c小鼠,检测免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群的数量。[结果]成功构建了重组表达质粒pIRES-ORF2-ORF5,W estern blot和IFA试验证实该重组质粒在BHK细胞内成功表达了目的蛋白。与灭活苗相比,pIRES-ORF2-ORF5核酸疫苗免疫小鼠ELISA抗体水平差异不显著;其脾T淋巴细胞亚群数量显著高于灭活疫苗免疫组。[结论]构建的二联核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,为更好地防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供了条件。 相似文献
10.
[目的]研究沙门氏菌感染宿州细胞过程中,沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的效应蛋白SopB对宿主细胞细胞骨架的影响,同时寻找SopB蛋白调控细胞骨架变化的相关结构域。[方法]利用基因克隆的方法分别构建含鼠伤寒沙门氏菌LT2效应蛋白SopB的全长基因、SopBN末端基因片段及SopB肌醇磷脂酶活性中心氨基酸C460突变体的重组质粒,使其均在HeLa细胞中过量表达,对表达结果进行检测。[结果]SopB重组质粒在HeLa细胞中均能正常表达,其中SopB蛋白的过表达能显著改变HeLa细胞的细胞骨架,使细胞由正常的细胞形态转变为圆形。[结论]通过比较SopB各基因片段对细胞形态的影响,发现SopB过表达在改变HeLa细胞骨架方面与其N末端第46～112位氨基酸残基间的肽断直接相关,而与其肌醇磷脂酶活性关系不大。 相似文献
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小麦矮秆基因Rht3和赤霉酸不敏感基因Gai3与a—淀粉酶的表达 总被引：6，自引：0，他引：6
以小麦赤霉酸反应不敏感的Ｒｈｔ３矮秆基因两个近等基因系及其分离群体为材料,分析了Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３与ａ－淀粉酶表达的相互关系。结果表明,Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３能强烈地抑制萌发籽粒ａ－淀粉酶的表达,降低ａ－淀粉酶活性水平。高矮亲本间ａ－淀粉酶活性差异明显,矮扬３、矮苏３和扬麦３号、苏麦３号的ａ－淀粉酶ＯＤ值分别为０．０７１,０．０８０和０．０６３５,０．７２０。经Ｘ＾２测验,两群体中ａ－淀粉酶生高、中、 相似文献
12.
从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。 相似文献
13.
[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。 相似文献
14.
动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状，而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动，获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料，通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体，使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry；使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达，而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白，对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。 相似文献
15.
《山西农业科学》2017,(5)
为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10~(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。 相似文献
16.
【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。 相似文献
17.
人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。 相似文献
18.
《黑龙江八一农垦大学学报》2015,(4)
为了构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并检测其在籽鹅颗粒细胞中的瞬时表达。利用PCR技术合成籽鹅FSH全基因后,构建促卵泡素α、β亚基真核表达载体,并转染籽鹅卵泡颗粒细胞。结果表明:基因片段已正确插入真核表达载体,同时在颗粒细胞中检测到pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β的融合蛋白表达。说明已构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并在颗粒细胞瞬时表达成功,为研究和开发生物制剂奠定基础。 相似文献
19.
为了构建含有EGFP的猪ProTα基因的真核表达载体,用RT-PCR从猪肾脏中扩增ProTα基因,连接到T载体,测序鉴定后,连接到pEGFP-N3真核表达载体,构建真核表达载体pEGFP-ProTα。通过脂质体法转染Vero细胞,进行荧光检测。结果表明,构建的pEGFP-ProTα真核表达质粒,转染Vero细胞后,经荧光观察EGFP-ProTα融合蛋白有向细胞核聚集的现象。结论:本研究成功构建了真核表达载体pEGFP-ProTα,并在Vero细胞中表达,为研究猪ProTα的功能奠定了基础。 相似文献
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小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。 相似文献