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为构建安全高效表达海洋源金属硫蛋白的益生菌重组菌株,以海洋源褶牡蛎内脏团为模板,PCR克隆得到褶牡蛎金属硫蛋白基因(Op-MT),大小为324 bp,经pMD19-T载体亚克隆到融合表达载体pHT43-SUMO中,然后通过电转化法将重组质粒转入八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N中。SDS-PAGE电泳显示诱导表达的融合蛋白SUMO-Op-MT分子量约为23 kD,与预期一致,说明可溶性融合蛋白SUMO-Op-MT在宿主菌中得到了表达,且通过Western blotting进一步得到验证。同时,HPLC检测重组枯草芽孢杆菌发酵液,结果也表明重组枯草芽孢杆菌成功表达了可溶性目的蛋白Op-MT。通过对重组工程菌中MT活性检测发现,其对重金属镉耐受力增强,说明重组工程菌成功表达出有活性的金属硫蛋白。这为以后开发天然、高效海洋源重金属解毒剂提供理论基础。 相似文献
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为探明鱼类消化液分泌的相关调控因子,采用RACE技术分别克隆了鳜(Siniperca chuatsi)两种肠道激素——胃泌素(gastrin,GAS)与胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)基因的cDNA序列。鳜GAS基因cDNA全长581 bp,5′非翻译区长100 bp,3′非翻译区长145 bp,开放阅读框长336 bp,编码111个氨基酸;鳜CCK具有2种类型:CCK1与CCK2,CCK1 cDNA全长为843 bp,5′非翻译区长60 bp,3′非翻译区长369 bp,开放阅读框414 bp,编码137个氨基酸;CCK2 cDNA全长846 bp,5′非翻译区长112 bp,3′非翻译区长332 bp,开放阅读框403 bp,编码134个氨基酸。鳜GAS与CCK成熟肽C末端具有相似的八肽结构(DYQGWVDF/DYLGWMDF),仅在C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量PCR分析表明,鳜GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂,CCK1与CCK2 mRNA在脑中表达量最高,在肠和幽门垂也有较高表达,表明GAS与CCK同为消化调控因子,而CCK还是神经分泌因子。鳜GAS与CCK mRNA表达贯穿于整个幼体早期发育阶段(孵化后0～22 d),前期表达水平较高,后期表达水平较低,并趋于平稳,GAS与CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。 相似文献
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金属硫蛋白(Metallothionenin,MT)是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质.MT在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用.本研究通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白(PmMT)全长cDNA序列.该序列全长599bp,5'UTR (Untranslated Region)为75bp,3'UTR为296 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为228bp,编码75个氨基酸.编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达到29.3%;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9.3%;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列.序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员. 相似文献
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大珠母贝（Pinctada maxima）金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析 总被引：1，自引：0，他引：1
金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质。MT在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用。本研究通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599bp,5’UTR（Untranslated Region）为75bp,3’UTR为296bp,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为228bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达到29．3％;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9．3％;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。 相似文献
6.
为检测在重金属胁迫下青海湖裸鲤钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)的动态变化,确定CN是否可以作为生物标志物对水环境中的重金属污染进行早期诊断,通过检测Zn~(2+)胁迫后青海湖裸鲤CN表达量的变化,研究了Zn~(2+)对青海湖裸鲤生存状态的影响。结果表明,Zn~(2+)对青海湖裸鲤的致死率与胁迫时间和离子浓度成正相关;通过实时定量PCR发现,CN在鳃、肌肉、肾脏和肝脏中均有表达;在Zn~(2+)浓度为1 mg/L时,随着胁迫时间的逐渐延长,鳃中CNAα、CNAγ和CNB均有逐渐增加的趋势,96 h时表达量达到最高水平;随着胁迫浓度的逐渐增加,CNAα、CNAγ和CNB表达量呈先升高后降低的变化趋势,在Zn~(2+)浓度为2 mg/L时,三者表达量均达到最高水平。研究结果显示,青海湖裸鲤钙调蛋白磷酸酶对锌离子胁迫产生了明显应答,可以作为重金属污染的候选生物标志物。 相似文献
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为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。 相似文献
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实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。 相似文献
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为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。 相似文献
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通过构建仿刺参cDNA文库,获得铁蛋白全长cDNA序列。该基因序列全长792 bp,5′非翻译区长133 bp,开放阅读框长522 bp,编码173个氨基酸,3′UTR长137 bp;预测蛋白分子量为20 ku。5′UTR具有一个高度保守的铁离子应答元件。仿刺参ferritin氨基酸序列具备脊椎动物ferritin的亚铁氧化酶活性中心所特有的保守结构。该序列与海参的同源性最高,达84%,与其它无脊椎动物如:海星、鲍、牡蛎、海葵、线虫、小龙虾和果蝇的同源性为74%~34%;与脊椎动物ferritin重链亚基同源性高于轻链亚基。系统进化分析表明,仿刺参的ferritin与大部分无脊椎动物聚为一支。利用半定量RT-PCR检测,ferritin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体、稚参11个发育阶段和幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均表达。Quantitative real-time PCR结果显示, ferritin mRNA在未受精卵至原肠期表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量显著增高;在幼参的不同组织中,ferritin mRNA在呼吸树中的表达量显著低于其他3种组织;幼参注射LPS后,4种组织中ferritin mRNA表达量与注射前无显著差异。 相似文献