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新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP46共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24～48h,实验细胞(共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46)和阳性对照细胞(共转染siRNA-GFP和pEGFP-ICP46)中的荧光微弱,发荧光的细胞数量较阴性对照(共转染siRNA-Negative和pEGFP-ICP46)少70%左右,但其后实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强,在转染后72h其与阴性对照组已差别不大。说... 相似文献
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新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)是一种重要的鱼类传染性病毒, 可导致石斑鱼死亡率达90%以上, 给石斑鱼的养殖造成巨大的经济损失。SGIV ICP46(infected cell polypeptides 46)是一个立即早期基因, 可能参与细胞的生长调控, 并对病毒复制有重要作用。在SGIV ICP46序列中存在一段富含亮氨酸(Leucine, L)的潜在核输出信号(nuclear export signal, NES)。为了深入研究该段NES序列在SGIV ICP46核转运过程中的作用, 实验构建了3个NES缺失的突变体: 仅含NES之前片段的突变体(ΔNESa)、仅含NES之后片段的突变体(ΔNESb)和不含NES的全长片段(ΔNESc), 并在真核细胞中表达, 观察这些突变体在细胞内的定位情况。转染细胞实验结果表明, 野生型EGFP-ICP46重组蛋白可以有效地被输出细胞核, 荧光信号主要分布在胞质区; 相反, NES缺失的EGFP-ICP46-ΔNES重组蛋白不能被有效地输出细胞核, 呈现与EGFP对照相同的泛细胞分布特征。突变实验证明, NES对SGIV ICP46输出细胞核具有决定性作用。 相似文献
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利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化。结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47%、68%、51%。3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好。Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60%、96%和55%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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石斑鱼虹彩病毒ORF050的分子特征和功能初步分析 总被引：1，自引：0，他引：1
新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖产业严重经济损失的主要病毒病原之一。SGIV 是大分子DNA病毒,包含162个基因开放阅读框,其中ORF050是一个肿瘤坏死因子受体类似物,可能在SGIV的免疫逃避中发挥作用。本研究克隆了SGIV ORF050基因,并构建了全长基因的真核表达重组质粒和四个半胱氨酸富集结构域(CRD)分别缺失的突变体。RT-PCR和药物抑制实验结果表明,SGIV ORF050是病毒的一个立即早期基因。亚细胞定位结果表明,该基因在细胞质内均匀地弥散性分布,并在细胞核周围聚集;第一个CRD缺失后,基因的定位发生明显的变化,即呈点状分布在胞质中,推测第一个CRD对其功能有影响。在过表达SGIV ORF050的鱼类细胞中观察SGIV感染引起的CPE,发现与对照相比没有明显区别;荧光定量PCR检测SGIV 主要衣壳蛋白MCP的转录表达水平,也没有明显变化,提示该基因对SGIV在宿主细胞内的复制增殖可能没有影响。荧光定量PCR检测过表达ORF050的细胞在SGIV感染后宿主TNF/TNFR的转录水平,结果显示在感染10 h后TNF1、TNF2和TNFR2的表达量升高了2～3倍,而TNFR1的表达量没有明显变化,说明SGIV可能通过ORF050来调节细胞TNF和TNFR的表达,从而逃避宿主的免疫攻击。 相似文献
5.
利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA( short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链( 19 nt) -环(4 nt) -负链(19 nt)].化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA -124、pshRNA-896和pshRNA-NNV.然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化.结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47％、68％、51％.3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好.Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60％、96％和55％,与对照组相比差异显著(P＜0.05).研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础. 相似文献
6.
在病毒感染宿主细胞过程中,病毒利用宿主细胞骨架如微丝、微管等完成进入、运输和释放等过程。为分离鉴定石斑鱼虹彩病毒SGIV囊膜蛋白,实验应用去污剂溶解病毒囊膜,然后结合1-D-SDS-PAGE切胶分离和LC-MS/MS质谱鉴定两种方法进行检测,除了病毒编码的囊膜蛋白外,还发现7种宿主细胞来源的蛋白,包括细胞骨架微丝肌动蛋白actin等,由此推测这些宿主蛋白是与病毒纯化过程中共纯化获得。鉴于actin在病毒感染中发挥着重要的作用,进一步通过蛋白印迹、免疫电镜实验验证了actin与病毒共纯化,揭示actin是一种来源于宿主细胞并包装到病毒颗粒表面的宿主蛋白,且由于特异性作用黏附于病毒粒子表面,在分离病毒囊膜时与囊膜蛋白共纯化。此外,荧光显微镜观察发现,在病毒感染晚期,细胞变圆,细胞微丝actin蛋白和SGIV病毒共定位于细胞膜,提示actin与病毒释放相关。同时电镜观察也表明,病毒在感染细胞中释放时获得由宿主细胞质膜衍生而来的囊膜,由此推测actin可能在病毒释放时特异性包裹于SGIV病毒表面。研究表明,actin参与石斑鱼虹彩病毒SGIV的释放过程。 相似文献
7.
采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-SRF构建成功,为进一步研究SRF在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。 相似文献
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探讨低温胁迫下,干扰生长抑制特异性基因2(Gas2)对罗非鱼肾脏细胞系增殖和凋亡的影响。采用脂质体转染法介导Gas2短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)及阴性对照短发夹RNA处理罗非鱼肾脏细胞,24 h后,以5℃/d降温速率对转染后的罗非鱼肾脏细胞进行低温胁迫,分别在25、20、15、10℃进行细胞采集。随后,利用实时荧光定量PCR检测Gas2基因及P53基因mRNA表达变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并开展WST-1细胞增殖实验检测细胞的增殖情况。结果表明,低温胁迫下,阴性对照组及Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达在15℃和10℃时均显著升高;Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达水平在所有温度下均显著低于阴性对照组;随着温度降低,阴性对照组及Gas2干扰组的细胞凋亡率均明显升高,但Gas2干扰组的细胞凋亡率明显低于阴性对照组;低温胁迫下,对照组及Gas2干扰组的细胞增殖率与25℃时相比均显著下降;当温度降至15℃时,Gas2干扰组的细胞增殖率显著高于对照组。罗非鱼肾脏细胞在受低温胁迫时,抑制Gas2基因能够降低P53基因mRNA的表达水平以及细胞的凋亡率,并增加细胞的增殖。 相似文献
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为探究视黄酸(Retinoic acid, RA)在鱼类精原干细胞(Spermatogonial stem cells, SSC)增殖与分化中的作用,本研究首先以三荧光报告载体pGRY(延伸因子1α启动子驱动组蛋白H2B-绿色荧光融合蛋白、减数分裂联会复合体蛋白3(Scp3)启动子驱动嘌呤霉素红色荧光融合蛋白、精蛋白启动子驱动黄色荧光蛋白)转染青鳉精原干细胞系SG3,获得稳转细胞SG3-pGRY,然后分别在2D与3D培养条件下检测RA信号对其增殖与分化的影响。结果显示,稳转细胞SG3-pGRY的红色荧光可监测细胞内源性Scp3的表达,且细胞仍保持干性及分化潜能,表明其可用于监测细胞分化状态。在2D培养条件下,即在细胞培养板中待细胞生长密度约90%就进行传代培养,RA可显著抑制细胞增殖,其受体α、β、γ泛抑制剂BMS493可促进细胞增殖；第48 h,RA处理可下调细胞多能性相关基因pou5f3、klf4表达,上调减数分裂相关基因dazl表达,但对其他减数分裂相关基因如scp3表达无明显影响；第8 d,处理组及对照组均未能观察到红色荧光,这与已有报道RA处理体外培养小鼠SSC可显著促进Scp3表达,并进入减数分裂I期偶线期的研究结果明显不同。在3D培养条件下,即用96孔球形低吸附微量培养板进行培养,48 h后细胞成球状体聚集生长,RA、 BMS493处理组、对照组在48 h后均观察到明显红色荧光,减数分裂相关基因表达与2D相比显著上调；第8 d与34 d,RA处理组减数分裂相关基因表达均显著高于对照组,而BMS493处理组低于对照组。综上,RA信号可抑制SG3增殖,促进其分化,但不是诱导细胞发生减数分裂的关键分子。本研究不仅为鱼类SSC分化相关研究提供了良好研究模型,而且促进了我们对于RA信号在鱼类SSC增殖与分化中作用的深入认识。 相似文献
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为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、虹鳟I型干扰素(IFN)基因克隆到真核表达载体pCI中构建出表达EGFP的IHNV微型基因组pCI-LFGT和表达IFN的IHNV微型基因组pCI-LFIT;将pCI-LFIT质粒转染已接种IHNV HLJ-09毒株的EPC细胞,实时荧光定量PCR法测定细胞中IHNV G基因RNA。结果显示:构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与5个辅助质粒共转染,外源基因均能正确表达;pCI-LFIT质粒转染已接种病毒的EPC细胞组与对照组相比其中的病毒核酸显著减少。 相似文献
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一种(鱼师)鱼诺卡氏菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆及功能初步研究 总被引：1，自引：1，他引：0
這鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,可导致鱼类慢性系统性肉芽肿疾病.這鱼诺卡氏菌全基因组序列分析发现了一个酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphtase,PTP)基因,生物信息学分析显示该基因很可能编码一个靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白.本实验对這鱼诺卡氏菌PTP进行了基因克隆、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和线粒体膜电位检测,结果显示,在這鱼诺卡氏菌胞外产物中质谱鉴定到了PTP肽段,证实其为分泌蛋白.亚细胞定位研究观察到PTP-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明這鱼诺卡氏菌PTP蛋白并未靶向定位于线粒体.亚细胞定位和过表达研究都显示PTP蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等明显的细胞凋亡特征.通过线粒体膜电位检测表明,在pcDNA-PTP转染后48 h,线粒体跨膜电位被明显破坏,说明這鱼诺卡氏菌PTP很可能是一种可诱导细胞凋亡的细菌蛋白.通过对這鱼诺卡氏菌PTP开展基因克隆和功能初步研究,为进一步揭示该基因的功能和深入了解這鱼诺卡氏菌的分子致病机理奠定了基础. 相似文献
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LrrG和表面免疫原性蛋白（Sip）是无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的2种表面蛋白,具有良好的免疫原性。为获得罗非鱼无乳链球菌表面蛋白LrrG和Sip蛋白的融合蛋白,该试验采用基因拼接技术中的双酶切法分2步逐个将Sip和LrrG基因插入pColdⅡ载体中,构建原核表达载体pColdⅡ-LrrG-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞BL21（DE3）,进行诱导表达条件的优化。结果显示,15℃、IPTG 0.5 mmol·L-1诱导9 h,目的蛋白呈可溶状态的表达量最高。Western Blot检测结果显示LrrG-Sip融合蛋白大小与预测一致（162kDa）,说明成功构建了融合基因,为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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研究了pH、氨氮胁迫对中国对虾Fenneropenaeus chinensis血细胞、肝胰腺、鳃和肌肉组织HSP90基因时空表达的影响.分别将中国对虾暴露于pH7.0、9.0的水体中148h和不同氨氮浓度的水体中96h,结果表明,pH（7.0,9.0）胁迫条件下中国对虾鳃、肌肉和血细胞HSP90基因表达均上调,肝胰腺HSP90基因表达对两种pH胁迫差异明显：pH7.0胁迫条件下,HSP90基因表达3h达峰值后明显降低;pH 9.0胁迫时,HSP90基因表达水平逐渐升高,整个胁迫过程中均显著高于对照组（P＜0.05）,说明中国对虾肝胰腺组织是高pH胁迫的响应器官.6mg/L氨氮浓度组鳃和肌肉组织HSP90基因表达水平24h达最高值,分别为对照组的5.46和1.55倍;各胁迫组肝胰腺和血细胞HSP90基因表达水平分别于6h和48h达到最高值,为对照组的1.33～2.08倍和2.20～5.45倍.肝胰腺组织对氨氮胁迫表现敏感,短时间内（6h）通过上调HSP90基因表达水平保护细胞;鳃组织HSP90基因表达波动范围最大,说明鳃组织需要更高表达量的HSP90保护细胞.当氨氮浓度持续48～96h维持在2～6mg/L,各组织HSP90基因表达水平显著降低. 相似文献
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学习记忆在动物获得新的觅食技巧和食物偏好方面扮演着重要的角色。为评估学习记忆对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)摄食调控的影响, 构建翘嘴鳜学习记忆相关基因 c-fos 及 zif268 荧光过表达载体, 并以 pcDNA3.1-EGFP 载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验, 优化电压、脉冲时间、质粒浓度和电击次数等电转条件, 确立最佳条件。利用电击的方式转染翘嘴鳜脑细胞, 检测食欲基因 mch、agrp、pomc、npy 表达变化。结果显示, 成功构建了学习记忆过表达载体 pcDNA3.1-c-fos-EGFP、pcDNA3.1-zif268-EGFP。翘嘴鳜脑细胞电转染的最适条件: 细胞密度 1×106 /mL、电压 240 V、脉冲时间 5 ms、质粒 6 μg、电击 1 次、转染 48 h, 可见大部分荧光蛋白表达, 转染率较高, 表明 pcDNA3.1-EGFP 在体外成功转染翘嘴鳜脑细胞。过表达 c-fos 基因后, 食欲相关基因 pomc 和 npy mRNA 水平均显著上升。而过表达 zif268 基因后, 并未发现食欲基因有差异表达。以上结果说明, 翘嘴鳜学习记忆相关基因 c-fos 的表达影响了食欲相关基因 pomc 和 npy 的表达。 相似文献
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为分析牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区和第一内含子调控序列的功能,本研究运用DNA重组技术将PCR扩增得到的牙鲆碱性磷酸酶基因的5′调控区序列、第一内含子序列及5′调控区和第一内含子串联序列分别插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pAcGFP1-1中,得到pAcGFP1-5′ALP、pAcGFP1-Intron1和pAcGFP1-AI报告基因表达载体。通过脂质体介导重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并检测荧光信号。转染后细胞状态良好,24 h后发现,在倒置荧光显微镜下均可看到不同强度的绿色荧光信号,且荧光信号随时间的延长而增强,其中转染pAcGFP1-AI后的荧光信号强度最强。以上结果表明,牙鲆碱性磷酸酶基因5′调控区和第一个内含子序列均具有启动子活性,且第一内含子与5′调控区存在协同效应,两者协同能增强基因的表达。为了解甲状腺激素T3对调控序列启动子活性的调节作用,用不同浓度的T3处理转染的CHO细胞,24 h后发现加入50、75和100 nM的T3都增强了绿色荧光蛋白的表达,而且信号强度随T3浓度的增加而增强。这表明甲状腺激素T3对牙鲆碱性磷酸酶基因调控序列的启动子活性有一定的增强作用。本研究为深入阐明牙鲆碱性磷酸酶基因转录表达的分子机制提供了实验依据。 相似文献
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通过体外重组，将绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到鲤鱼肌动蛋白基因启动子下游，构建成能在鱼体内表达绿色荧光蛋白的重组分子。用限制性内切酶PvuI酶切线性化后，通过显微注射法导入金鱼受精卵内，在转化后48h，可观察到绿色荧光，经PCR初步筛选后，对显阳性个体进行Southern杂交检测，结果表明，转化个体表现出较强的杂交信号。这说明绿色荧光蛋白基因能在金鱼体内整合、表达。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7基因真核表达载体pCI-VP7的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
将编码草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)主要衣壳蛋白VP70.9kb的基因片段连接至克隆载体pMD19-T中,筛选阳性克隆并测序,经检测为正确序列后,再将目的片段克隆入真核表达载体pCI,筛选得到阳性重组质粒pCI-VP7。然后构建pCI-VP-GFP重组表达质粒(即GFP基因与VP7的一段上游基因融合表达),用PCR及酶切方法鉴定克隆的正确性。并用脂质体法将其转染入真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及RT-PCR特异性检测。结果表明,GFP基因与VP7的一段上游基因被成功转染到COS-1和CIK细胞,并得到了很好的表达。进而证明pCI-VP7可以成功的表达,为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。 相似文献
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斜带石斑鱼抗菌肽hepcidin基因克隆及其成熟肽的原核融合表达 总被引：1，自引：0，他引：1
文章根据已报道的硬骨鱼类hepcidin cDNA序列设计简并引物,通过RT—PCR从重要海水经济鱼类斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝脏中扩增出1条具有完整开放阅读框的246bpcDNA序列,Blast分析表明该序列是鱼类hepcidin基因家族的一员,被命名为斜带石斑鱼hepcidin样抗菌肽前体,该cDNA所推导的氨基酸序列有如下特点：1）信号肽序列与多数鱼类hepcidin信号肽的同源性在67％～87％之间;2）C端20个氨基酸序列具有绝大多数动物hepcidin成熟肽的共同典型保守序列特征,即在对应位置具有8个Cys;3）序列中不具有已报道的hepcidin前体肽转化酶作用典型基序[RX（K／R）R];4）与GenBank中已注册的2条斜带石斑鱼hepcidincDNA序列（GU391241和GU391242）所推导的氨基酸序列同源性分别为36％和33％,且NJ进化树显示不与这2条序列聚为一枝,表明该序列是斜带石斑鱼hepcidin基因家族中一种新亚型,其预测成熟肽融合表达载体成功在大肠杆菌（Escherichiacoli）中表达,为后续研究奠定基础。 相似文献