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1.
家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析 总被引：2，自引：1，他引：1
设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。 相似文献
2.
烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。 相似文献
3.
《蚕业科学》2015,(1)
Dicer是一种具有RNaseⅢ酶活性的蛋白质,参与RNAi起始阶段siRNA和miRNA的形成,为RNA诱导沉默复合物(RISC)形成的关键因子之一,在基因的转录后调控中扮演重要角色。采用生物信息学方法从家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)全基因组数据中鉴定到一个Dicer相似蛋白(Dicer-like)基因,命名为Nb DCL(Gen Bank登录号:EOB15391)。预测Nb DCL的二级结构中含有RNaseⅢ结构域和dsRNA结合结构域。基于Dicer-like基因的系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的亲缘关系最近,并与真菌形成姊妹枝,说明微孢子虫Dicer-like与真菌的同源基因来自共同的祖先。基因组共线性分析显示,Dicer-like基因及其两侧基因在微孢子虫基因组中的排列顺序具有显著的保守性,但兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)和比氏肠道微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)基因组中的Dicer-like基因在物种分化过程中发生了丢失。对Dicer-like基因和Agronaute相似蛋白基因、转座子的共存分析表明,家蚕微孢子虫等Nosema属微孢子虫均保留了古老的RNAi作用机制。RT-PCR检测被家蚕微孢子虫感染48~240 h的家蚕幼虫中肠中Nb DCL基因均有转录。研究结果为进一步探究家蚕微孢子虫RNAi的调控机制提供了有益线索。 相似文献
4.
重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析 总被引：1，自引：1，他引：0
用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。 相似文献
5.
从家蚕体内分离得到一株新的病原性微孢子虫,编号为GXM1。光学显微镜下观察GXM1微孢子虫为长卵圆形,大小(1.85±0.15)μm×(4.19±0.18)μm,在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,发育速度缓慢,发育周期约8～10 d。GXM1微孢子虫与家蚕微孢子虫(Nb)的抗血清产生阳性凝聚反应。利用透射电子显微镜观察到GXM1微孢子虫的超微结构具双核,极丝11～12圈,极丝倾斜角约45°。以上生物学性状显示GXM1微孢子虫具有微孢子虫属(Nosema)的基本分类特征。依据GXM1微孢子虫与其它昆虫微孢子虫的SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及序列相似性和遗传距离分析,进一步证实GXM1微孢子虫属于Nosema属。GXM1微孢子虫对蚁蚕的半数感染浓度(IC50)为6.06×105mL-1,对家蚕的胚种传染率可达23.28%,是一株具有较强致病性和危害性的家蚕病原性微孢子虫。 相似文献
6.
家蚕微孢子虫保存株DNA的特异性扩增 总被引：1，自引：0，他引：1
尝试研制成了一种微孢子虫检测的新系统。以家要微孢子虫小亚单位rRNA基因的推导假基因及保守序列为引物,对家蚕微孢子虫(Nosemabombycis.Nb)保存株的DNA进行了特异的PCR扩增。检测了六株微孢子虫:三株为家蚕微孢子虫株系,即保存株SES—NU、NIS—001和分离自草地贪夜蛾(Spodoptera depravata)的株系Sd—NU—IW8401;及三个种:Nosema Sp.株NIS—Mll,变形孢子虫属的分离株Vainmorpha Sp.NIS—M12和具褶孢子虫属分离株Pleistoophora Sp.PI—NU,以此六株微孢子虫的DNA为模板进行PCR扩增,仅家蚕微孢子虫(Nb)的保存株SES—NU、NIS—001获得扩增产物。 相似文献
7.
利用GENETOOL、TREECON软件包,对克隆的家蚕病原性微孢子虫Endoreticulatus bombycis的SSUrRNA(small subunit ribosomal RNA)序列和 GenBank中已登录的其他微孢子虫SSUrRNA序列进行了进化分析,构建了微孢子虫的进化树。该进化树显示:微孢子虫门分为4大类群,除第一、第二类群由双单倍期纲(Class Dihaplophasea cl.n.Sprague,1992)构成之外,其它2个类群均由双单倍期纲和单倍期纲(Class Haplophase cl.n.Sprague,1992.)构成;双单倍期纲分布在4个类群中,显示了微孢子虫发育呈现多系性;在真核生物中,缺乏线粒体营独立生活的双滴虫(Diplomonadida)首先从原核生物中分离出来,接着是毛滴虫(Trichomonadida),然后是微孢子虫和真菌(Fungi),显示出了微孢子虫与真菌有较近的亲缘关系;微孢子虫的4大类群中,双单倍期纲中离异双倍期目(Dissociodihaplophasida)起源最早;单倍期纲中格留目(Glugeida)进化程度最高。家蚕病原性微孢子虫Endoreticulatus bombycis位于第三类群中,处于相对较高的进化位置。 相似文献
8.
半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。 相似文献
9.
玉米螟微孢子虫作为玉米螟田间种群自然控制因子之一,能否交叉感染家蚕,其与家蚕微孢子虫的血缘关系值得探究。通过对实验室搜集的家蚕微孢子虫和玉米微孢子虫进行了电镜水平的超微结构观察和分析,进而对它们的16S r DNA基因进行了PCR扩增、测序和系统发育分析,结果显示玉米微孢子虫与家蚕微孢子虫均属Nosema属,分别落在不同进化枝上的种,这可能暗示了玉米螟微孢子虫不能直接感染家蚕的部分缘由。 相似文献
10.
糖蛋白在免疫识别、信号转导等生命进程中扮演重要角色。为研究微孢子虫糖蛋白及其糖基化类型,采用比较基因组学方法对微孢子虫O-甘露糖糖基化通路进行分析。真核生物的O-甘露糖糖基化通路中有6种主要酶类,包括己糖激酶、磷酸甘露糖酶、GDP甘露糖磷酸化酶、Dol-P甘露糖合成酶、甘露糖转移酶、Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶。通过生物信息学方法分析家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、比氏肠道微孢子虫(Encephalitozoon bieneusi)和柞蚕微孢子虫(Nosema antheraea)的这6种酶基因编码氨基酸序列特征及结构域类型,发现这些酶的垂直同源基因比较保守,多重序列比对表明在6种微孢子虫之间,6种酶的氨基酸序列相似性比较高,系统进化分析显示同属的微孢子虫多聚为一簇。研究结果表明,N.bombycis、N.ceranae、E.cuniculi、E.intestinalis和N.antheraea 5种微孢子虫的O-甘露糖糖基化的蛋白质修饰通路是完整、保守的,然而在E.bieneusi中,其关键酶Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶的氨基酸序列比较短,只有342个氨基酸,缺失了关键结构域PMT,因此可能无法完成O-甘露糖糖基化修饰。以上微孢子虫的O-甘露糖糖基化通路中6种主要酶的序列信息,为后续解析家蚕微孢子虫糖基化通路及对糖蛋白糖基化类型与功能的研究提供了线索。 相似文献
11.
以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在 15以上 相似文献
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家蚕微孢子虫cDNA文库的构建及部分EST同源性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以成熟的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)为实验材料 ,以λTriplEx2为载体 ,构建了滴度为 1 86× 10 6pfu/mL ,插入片段平均在 5 0 0bp以上的较高质量的家蚕微孢子虫cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取 180个克隆进行EST测序 ,得到了 130个有效序列。经BLASTn、BLASTx同源性分析后发现 ,7个ESTs编码基因在氨基酸水平上与脑孢虫有较高的同源性 ,推定为家蚕微孢子虫基因 (putativegene) ,同时获得了 2 7个未知序列。 相似文献
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家蚕微孢子虫全基因组分析支持微孢子虫与真菌的亲缘关系 总被引：1，自引：1，他引：0
微孢子虫(microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,虽然分子生物学的研究证据表明其与真菌(fun-gi)存在亲缘关系,但这些证据均是基于单个或少数几个基因构建系统进化树而得出的。利用家蚕微孢子虫全基因组数据,采用基于基因同源性的Darkhorse基因组统计方法,鉴定家蚕微孢子虫基因组中每个基因的来源谱系,并通过全基因组谱系可能性指数(lineage probability index,LPI)分析微孢子虫与其他物种的亲缘关系。结果表明家蚕微孢子虫与其他微孢子虫的LPI加权平均值为0.93,具有最近的亲缘关系,与真菌界的LPI加权平均值为0.65,与原生生物界的LPI加权平均值为0.38。由此证明微孢子虫与真菌存在着更近的亲缘关系,微孢子虫门属于真菌界而非原生生物界。 相似文献
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从广州市萝岗桑园周边捕捉到的野外昆虫藤粉蝶(Delias pasithoe)成虫体内分离到1株微孢子虫,经人工接种可在家蚕体内全身性寄生。用透射电子显微镜观察到该微孢子虫为双核,极丝11～12圈,极丝同型,基本符合Nosema属微孢子虫超微结构特征。该微孢子虫在其生活史发育过程中以偶倍数核为主,以二分裂方式增殖,形成双核孢子,发育周期为108 h。基于SSU rRNA和rRNA ITS序列的相似性比较和系统进化分析进一步证实该微孢子虫与Nosema属亲缘关系最近,应被分类为Nosema属‘true’Nosema亚群。 相似文献
15.
从各自的微孢子虫基因组获得了两个能分别与家蚕微孢子虫和新西兰草金郇微孢子虫特异杂交的DNA片段,并对其进行了测序。尚没有发现该DNA片段能与供试的其它4个微孢子虫分别来自[蜜蜂微孢子虫、小菜粉蝶的变形孢虫(Vairimorpha sp.),新西兰草金龟和掘孔蛴螬(Wiseana sp.)的两株微孢子虫(Vavraia oncoperae)]的基因组DNA杂交。家蚕微孢子虫探针不与新西兰草金龟微孢子虫基因组DNA或与该微孢子虫原始昆虫寄主家蚕的DNA杂交。同样,新西兰草金龟微孢子虫探针不与家蚕秃孢子虫基因组或与新西兰草金龟的DNA杂交。两个DNA片段富含AT(分别占总碱基的59和79％),G+C/A+T的比率为0.70和0.25,表示其为散布于整个基因组中的重复序列。 相似文献
16.
几丁质是构成家蚕微孢子虫细胞壁的主要成分,广泛分布于原生生物、真菌、节肢动物和甲壳类生物之中,能够被几丁质酶(EC 3.2.1.14)水解。本文基于家蚕微孢子全基因组数据,采用生物信息学方法,鉴定获得家蚕微孢子虫几丁质酶基因,命名为Nb_chi。该基因有2个拷贝,其中一个Nb_chi_1长度为2 286bp,编码761aa,pI为6.35。含有一个信号肽以及一个Glyco_hydro_19结构域。另一个拷贝Nb_chi_2仅含552bp,183aa,仅含Glyco_hydro_19结构域部分,可能为一不完整的拷贝。系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与其他种类的微孢子虫聚在同一个进化枝,均属几丁质酶第19族。本文为深入进行家蚕微孢子虫几丁质酶的功能研究奠定了基础。 相似文献
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6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)是戊糖磷酸途径的限速酶,参与生物体内递氢体NADPH的产生。通过检索微孢子虫数据库获得家蚕微孢子虫6PGDH基因序列,以家蚕微孢子虫镇江株基因组为模板,设计特异性引物成功克隆了该基因,命名为Nb6PGDH,并对该基因进行序列特征和表达特征分析,为了解6PGDH基因在微孢子虫生长发育过程中的功能提供有用信息。克隆得到的序列全长1 374 bp,包含一个完整的ORF,编码457个氨基酸;与Gen Bank数据库中家蚕微孢子虫6PGDH基因长度相同,相似度为99. 42%,其中8个碱基存在差异,编码的3个氨基酸发生改变。生物信息学分析表明Nb6PGDH蛋白没有信号肽,无跨膜结构域,分子质量为51. 8 k D,等电点5. 83,存在38个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR分析结果表明,家蚕微孢子虫感染家蚕后2~168 h,中肠组织中Nb6PGDH基因都有所表达,且表达水平在生长发育过程中发生变化,说明Nb6PGDH基因在家蚕微孢子虫增殖发育过程中具有一定的生理功能。 相似文献
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SUMO(small ubiquitin-like modifier)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme)是SUMO修饰靶蛋白过程中唯一的E2结合酶,在SUMO修饰过程中发挥关键作用。本研究克隆了家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)NbUbc9基因的完整开放阅读框。序列分析表明,NbUbc9与所有来源于微孢子虫属(Nosema)的Ubc9聚类在同一大分支上,与同为Nosema属的西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)Ubc9同源性最高,说明NbUbc9蛋白在进化上高度保守。qRT-PCR分析表明,家蚕内源性Ubc9的表达量在Nb感染后有所下降,而Nb自身NbUbc9的表达显著增加。对NbUbc9基因RNAi后,Nb基因组DNA的复制水平显著下降,说明NbUbc9在Nb的细胞增殖中起着关键作用。经Pull-down和质谱分析,初步鉴定出有46个家蚕蛋白和8个Nb蛋白可能与NbUbc9相互作用,涉及蛋白质折叠与转运、去泛素化、信号转导等。研究结果为进一步研... 相似文献
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《蚕业科学》2017,(1)
选择家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白质谱数据库中新发现的假定表面蛋白NBO_33g0013进行研究,了解该蛋白质的功能及是否参与微孢子虫对宿主细胞的侵染过程。预测该蛋白质分子质量为26.1 k D,等电点为4.59,其序列N端具有信号肽,无跨膜螺旋结构,含3个N-糖基化位点,无O-糖基化位点,不具有典型的功能结构域,与柑橘凤蝶微孢子虫(Papilio xuthus)的一个假定蛋白序列相似度达到93%。以家蚕微孢子虫CQ1分离株的基因组DNA为模板克隆该蛋白质的编码基因,构建重组表达载体进行该蛋白质的原核表达,并制备获得多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析确证该蛋白质定位在家蚕微孢子虫孢子表面。经体外细胞感染实验初步分析,尚未发现该蛋白质参与了微孢子虫孢子对宿主Bm E细胞的粘附过程,推测该蛋白质可能为家蚕微孢子虫孢壁的结构组成型蛋白质,在孢壁的构架形成中发挥作用。 相似文献
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微孢子虫(microsporidia)长期专性细胞内寄生,其基因组表现出显著的减缩性。利用家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)基因组数据库探究在其显著减缩的基因组中是否有编码序列发挥调控序列的作用,结果发现在DNA转录调控中发挥重要作用的细胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein)的N端编码序列具有典型的真核生物启动子序列特征。设计引物扩增该基因N端590 bp包含启动子基序的序列(C启动子序列),将该启动子序列克隆到载体启动子(MET25-P)被终止序列(CYC1-T)替代的pUG35载体上,构建由该启动子序列启动下游绿色荧光蛋白(GFP)表达的克隆载体ΔpUG35-CYC1-T-C-yEGFP-CYC1-T,并将其电击转化酿酒酵母CEN.PK2菌株,经筛选及诱导培养后,在荧光显微镜下观察到酵母中有GFP表达,证实了家蚕微孢子虫细胞分裂周期蛋白的N端编码序列包含具有启动子活性的序列,表明家蚕微孢子虫基因组减缩后,部分编码序列可能扮演了调控序列的角色。研究结果也为微孢子虫启动子的活性验证提供了一个简便的途径。 相似文献