共查询到20条相似文献，搜索用时 31 毫秒
1.
参考Gen Bank中收录的E.acervulina ADF基因序列设计1对特异性引物,以河北保定株堆型艾美耳球虫子孢子DNA为模板,用聚合酶链式反应(PCR)法扩增ADF基因。将扩增的ADF基因克隆至p MD18-T载体,转化感受态细胞DH5α,蓝白斑法筛选出阳性重组子,提取阳性质粒进行PCR、酶切鉴定及对序列确证。将扩增产物与原核表达载体p ET32a(+)连接,构建重组质粒p ET32a-ADF,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。用E.acervulina重组质粒p ET32a-ADF免疫雏鸡,观察其对雏鸡细胞免疫和体液免疫功能的影响。结果显示,ADF基因扩增产物为729 bp,与预期结果相符。序列分析结果表明,该株的ADF基因序列与参考序列同源性达99.6%。表达出的ADF重组蛋白相对分子质量大小约为46 000。与健康对照组相比,重组质粒组淋巴细胞的增殖能力明显增强(P0.05),外周血中Ig G及IL-2含量均显著升高(P0.01),表明p ET32a-ADF质粒DNA能有效提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平。 相似文献
2.
3.
为构建牛分支杆菌αg85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出αg85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒.将此重组质粒转化人大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定.酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同.结果表明,成功地克隆并构建了αg85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b. 相似文献
4.
《畜牧与兽医》2016,(1):1-4
人工合成玉米赤霉烯酮降解酶基因zhd101,以质粒p ET32a(+)为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导转化子,通过SDS-PAGE鉴定ZHD101蛋白表达水平,并纯化ZHD101蛋白。结果表明,重组质粒p ET32a(+)-zhde101经HindⅢ、SacⅠ酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳证实zhd101正确插入p ET32a(+)载体。重组菌经IPTG诱导后,表达的ZHD101蛋白分子量为47.5 ku,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的35%,纯化后的ZHD101蛋白样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度为95%左右。试验结果为进一步研究ZHD101蛋白功能奠定了基础。 相似文献
5.
为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。 相似文献
6.
《贵州畜牧兽医》2015,(6)
利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的p MD18-H质粒,根据其序列设计带有Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段。将该片段克隆到p MD18-T载体内,用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将阳性克隆再用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体p ET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒p ET32-H,后经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定。结果表明,p ET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基。该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础。 相似文献
7.
为探讨1型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)p25蛋白的免疫原性,从RA 1型基因组DNA中扩增出p25基因全长ORF,生物信息学分析显示其为含有完整保守结构域PRK00110的一未知功能保守蛋白.p25基因经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a(+)-p25.测序正确后,将重组表达质粒pET-32a(+)-p25转入E.coli Rosetta,并成功进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明,表达的重组蛋白与预期大小一致,表达产物主要以可溶性形式存在;Western blotting检测显示,该蛋白具有良好的免疫原性. 相似文献
8.
《中国畜牧兽医》2015,(6)
为了克隆也木勒白羊抑制素α(inhibinα,INHα)亚基基因和表达其重组蛋白质,本试验采集发情期也木勒白羊卵巢组织,并从中快速抽提总RNA,以此作为模板并根据白羊INHα亚基基因编码区序列(GenBank登录号:XM_004004955.1)设计合成1对引物,经反转录扩增获得了也木勒白羊INHα亚基基因编码区全长序列。并将扩增产物克隆到表达载体(pEGFP-N1)的ScalⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间,构建重组质粒pEGFP-INHα并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,后进行鉴定、测序,证明成功构建了INHα亚基基因的真核表达载体。将也木勒白羊INHα亚基基因与人、大猩猩、牛等动物的INHα亚基基因序列进行同源性比对分析,相似度都在50%以上,说明了抑制素基因具有高度保守性。用RT-PCR和Western blotting方法验证了INHα亚基基因的真核表达载体在BHK细胞中的成功表达及蛋白表达。 相似文献
9.
为了对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2193基因进行克隆及其原核表达,采用PCR方法扩增lmo2193基因,连接pMD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。将目的基因克隆至原核表达质粒p ET32a中,构建重组质粒pET32a-2193,并转化大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达后,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果显示:扩增得到的lmo2193基因序列长度为1 077 bp,与预期一致;该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE检测和Western blot鉴定分析表明该产物为1个60 ku左右的融合重组蛋白。本研究成功克隆lmo2193基因,并获得大量表达,为进一步研究lmo2193基因功能奠定基础。 相似文献
10.
《黑龙江畜牧兽医》2014,(15)
为了构建鸡α干扰素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞中扩增α干扰素基因序列,将扩增产物定向插入到pMD18-T克隆载体中,进行序列测定;测序正确的质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切,将目的基因片段定向克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-IFN-α;将重组质粒转染293T细胞,使用间接免疫荧光、Western-blot等方法检测目的蛋白。结果表明:已成功扩增出582 bp大小的鸡α干扰素基因片段,测序结果与GenBank报道的序列基本一致。说明阳性重组质粒pCAGGS-IFN-α真核表达载体构建成功,能正确表达鸡α干扰素。 相似文献
11.
构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。 相似文献
12.
禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性. 相似文献
13.
《中国兽医学报》2016,(2):265-270
克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。 相似文献
14.
《中国动物传染病学报》2019,(3)
为研究堆型艾美耳球虫阳离子转运ATP酶(Eimeria acervulina Na+-K+-ATPase,Ea NKA)蛋白的生物学功能,根据Ea NKA基因(GenBank登录号:EU590120.1)设计1对特异性引物,以堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板,对Ea NKA基因进行PCR扩增,将PCR扩增产物克隆入pUCM-T载体并进行测序鉴定,将测序获得的Ea NKA基因编码蛋白进行生物信息学分析。Ea NKA基因全长1157 bp,位于第81-368 bp之间,编码236个氨基酸,分子量约为25 kDa。编码蛋白主要位于内质网,不具有信号肽,编码蛋白主要位于内质网,不具有信号肽,有12个结构功能域,2个跨膜区,位于多肽N端的7个抗原表位。Blast分析显示其编码蛋白与堆型艾美耳球虫阳离子转运ATP酶相关蛋白序列(XP013248919、ACB97673)的同源性为100%。构建重组质粒p ET32a(+)-Ea NKA并进行测序鉴定,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞,进行SDS-PAGE和Western blot表达鉴定。结果显示,构建的重组质粒可在原核细胞中成功表达45 kDa的融合蛋白。本研究成功获得Ea NKA基因的全长序列,并在原核细胞中成功表达,为今后研究该基因的功能及筛选基因工程疫苗候选分子奠定基础。 相似文献
15.
猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
16.
猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础.以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达.PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白.成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因. 相似文献
17.
通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。 相似文献
18.
[目的]获取羊口疮病毒B2L基因编码蛋白。[方法]根据GenBank上羊口疮病毒ORFV/ShanXi/2011/China株B2L基因序列,设计并合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增B2L全基因序列,然后将扩增的B2L基因克隆到PMD18-T载体上;对构建的重组克隆质粒(PMD18-T-B2L)经过测序鉴定后,将目的基因亚克隆到PET-32a(+)原核表达载体上,获得重组表达质粒PET-32a-B2L,然后通过双酶切和测序进行鉴定;将重组菌于37℃、终浓度含1 mM IPTG的LB培养基中,诱导表达3h后进行SDS-PAGE分析;表达的目的蛋白经过层析纯化后,进行Western Blot鉴定。[结果]原核表达重组质粒构建成功;SDS-PAGE鉴定发现目的条带的分子量与预期大小相符;纯化的目的蛋白经Western Blot鉴定正确,表明蛋白表达成功。[结论]本研究成功构建了羊口疮病毒B2L基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了B2L蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立打下了基础。 相似文献
19.
《广东畜牧兽医科技》2021,46(3)
本研究旨在构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)原核表达体系,制备其S1目的蛋白,为建立IBV ELISA检测方法奠定基础。以IBV QX型基因为模板,PCR扩增出S1蛋白基因,连接至p ET-32a原核表达载体,获得重组质粒p ET(32a)-S1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞后进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,重组S1蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,分子量约为60 k Da。Western-blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。利用Kcl染色法,成功纯化S1目的蛋白。本研究成功构建了p ET(32a)-S1重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,为进一步制备S1蛋白抗体奠定了基础。 相似文献
20.
利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础. 相似文献