胸膜肺炎放线杆菌ApxI A基因C端的克隆、表达及检测     

费东亮  肖银霞  赵刚  白刃  苏禹刚  米丰泉 《黑龙江畜牧兽医》2012,(15):104-106

为了研究ApxI A基因C端基因的免疫原性,试验采用分子生物学技术设计1对引物,采用PCR方法扩增得到ApxI A的C端基因片段,经酶切鉴定和基因测序后,构建原核表达载体pET-32a-AC;将重组质粒转化至宿主菌BL21中诱导表达,然后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测。结果表明:目的基因能够在原核表达系统中表达,其表达产物具有免疫学活性。  相似文献   

胸膜肺炎放线杆菌血清10型ApxIA基因的克隆及原核表达     

富亮  徐福洲  赵玉军  刘莹 《吉林畜牧兽医》2006,27(4):6-8,11

Apx毒素在胸膜肺炎放线杆菌致病性和免疫原性方面具有重要作用。为研究ApxI毒素的免疫活性，参照胸膜肺炎放线杆菌血清10型ApxIA基因核酸序列（D16582）设计1对引物．利用PCR自该菌株基因组DNA中扩增出3158bp的ApxIA基因片段，经克隆和序列测定后转入原核表达载体pET-32a中，通过转化BL21（DE3）并在IPTG诱导下进行原核表达，表达出约的融合蛋白，SDS-PAGE和Westernblotting鉴定结果显示表达产物大小约120kDa，且表达产物可与该菌株免疫兔血清发生结合反应。ApxIA基因的克隆和原核表达为研究ApxI毒素的免疫原性以及在胸膜肺炎放线杆菌中的生物学活性奠定了基础。  相似文献   

猪胸膜肺炎放线杆菌整合膜蛋白基因的克隆与表达     

《黑龙江畜牧兽医》2010,(7)

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的保护性免疫机制,试验采用筛选APP3～8kb随机基因组文库的方法获得1株阳性克隆,经测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为APP整合膜蛋白(IM)基因,预计成熟蛋白分子质量为48.431ku。根据序列设计特异性引物并PCR扩增该基因,分子克隆表达该整合膜蛋白。Western-blot分析表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应,说明该蛋白在免疫应答中起作用。  相似文献   

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定     

赵卫平逯忠新  陈振文杨学山 赵萍高鹏程  储岳峰 《中国兽医科技》2004,34(5):13-15

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)7型的DNA提取物中扩增出大小为2873bp的APXⅡA基因片段；将PCR产物重组到质粒载体pMD18-T中，并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明，克隆片段为完整的目的基因，该片段的核苷酸序列与国外分离株M30602的同源性达99．7％。  相似文献   

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达   总被引：6，自引：1，他引：6  

王方昆  王一成  袁秀芳  徐丽华 《中国兽医学报》2007,27(5):657-660

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。  相似文献   

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立   总被引：14，自引：3，他引：14  

梁金华  刘镇明  顾万军  王淑敏  冼琼珍  黄良宗 《中国预防兽医学报》2004,26(1):36-38

APXⅣA基因是新发现的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的RTX毒素基因,本文通过PCR方法从APP标准血清1型及临床分离到的3株野毒株中扩增出长为442 bp的部分APXⅣA基因,而从其它引起猪呼吸道疾病的细菌中无法扩增出此片段.通过玻板凝集试验鉴定这三株野毒株为血清1型APP.所建立的PCR方法能检测的DNA量最高敏感度为28pg.表明本文所建立的对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR诊断方法具有较高的特异性和敏感性.  相似文献   

猪PHGPx基因真核表达重组质粒的构建与鉴定     

刘平  李庆阳  谢永福  况绍祥  王林川 《广东畜牧兽医科技》2011,36(6):36-37,40

从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E．coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载...  相似文献   

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达     

邵美丽刘思国  王春来郭设平宫强  佟恒敏 《中国兽医科技》2006,36(1):25-28

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清7型25-4株基因组DNA为模板，用PCR扩增外膜蛋白（OMP）基因特异片段，并克隆于pMD18-T中，经酶切及核苷酸序列分析鉴定后，亚克隆于原核表达栽体pGEX-6P-1，成功构建了重组表达载体pGEX-omp；以此转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），经SDS-PAGE鉴定，表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku，命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解，获得切掉标签的OMP。经ELISA检测，该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应，具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APP OMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。  相似文献   

猪传染性胸膜肺炎的PCR快速诊断及基因组酶切分析     

肖根辉  宋德平  王萍  何后军  邓舜洲  张文波  戴益民  邬向东  朱芝秀 《黑龙江畜牧兽医》2011,(13)

为了建立猪胸膜肺炎放线杆菌(Actionbacillus pleuropneumoniae,APP)快速PCR诊断方法,试验依据APP的毒素基因Apx ⅣA的序列设计引物,对江西农业大学动物科学技术学院预防兽医学教研组保存的4个血清型APP菌株以及大肠埃希杆菌、沙门杆菌进行PCR扩增,同时对提取的4个血清型菌株的基因组DNA用EcoRⅠ酶切。结果表明:4个APP菌株均成功扩增出预期大小的基因片段,而其他G-菌没有扩增出;4个血清型菌株的基因组DNA经EcoRⅠ酶切后酶切片段有所不同。  相似文献   

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxI毒素中和试验的建立与初步应用     

《中国预防兽医学报》2021,(2)

为建立测定血清中猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)外毒素ApxI中和抗体的方法,本研究采用(NH4)2SO4沉淀法从血清10型APP培养液中经盐析浓缩提取具有溶血活性的天然毒素ApxI,将毒素与待检血清在37℃孵育2 h,加入4%猪红细胞悬液并反应0.5 h,利用酶标仪测定反应混合物上清液的OD540nm值判断溶血程度,计算出能够保护50%红细胞不发生溶血的最低血清稀释倍数,即为该血清的中和效价。利用该方法进一步检测了副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌等阳性血清,无交叉反应,表明该方法特异性较强;利用该方法最高能够检测到中和效价为1.1 580的APP ApxI毒素抗体阳性的猪血清,表明建立的中和试验具有较高的敏感性;以BALB/c小鼠为模型的感染试验结果表明,当其血清中ApxI毒素抗体的中和效价达到1.20时能够为小鼠提供有效保护。采用建立的方法检测临床采集的103份猪血清样品,能够有效检测其中和抗体,表明该方法可以应用于临床检测可分泌ApxI毒素的APP的感染和含ApxI毒素的亚单位疫苗免疫效果评估,为评价亚单位疫苗的免疫效果和猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了技术支持。  相似文献