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1.
为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。 相似文献
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为构建牛分支杆菌αg85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出αg85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒.将此重组质粒转化人大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定.酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同.结果表明,成功地克隆并构建了αg85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b. 相似文献
3.
应用特异性引物,从鸽新城疫F基因重组质粒pMD-18T-PPMV-1-F中PCR扩增F基因,用EcoRⅠ和NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将F基因定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ和NotⅠ位点,构建重组质粒pPIC9K-PPMV-1-F,对重组质粒鉴定后用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中,影印接种法筛选G418抗性菌株,提取酵母染色体DNA进行PCR鉴定,筛选出鸽新城疫F基因的高拷贝重组菌株。 相似文献
4.
犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。 相似文献
6.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的套式PCR检测 总被引：4，自引：0，他引：4
根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)apxⅣA毒素基因的序列,设计了两对特异性引物P1/P4和P6/P8,建立了检测APP全部15个血清型的套式PCR方法.对APP的15个国际标准血清型和国内的APP菌株进行了PCR检测,都能得到223 bp的特异性扩增产物;检测的灵敏度可达1.3 CFU,最低检出DNA浓度为9 fg. 相似文献
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用植株转化法将GUS基因导入桑树幼苗的研究 总被引：5，自引：2，他引：3
为探讨简便易行的农杆菌介导的转化方法 ,用工程农杆菌A 110株 (LBA4 4 0 4 /pIG12 1 Hm)对桑幼苗子叶腋隙进行刺伤感染 ,感染部位长出的桑芽表型异常。取其基因组DNA进行分子生物学鉴定 ,结果显示 :以基因组DNA为模板 ,经PCR反应后得到特异性扩增片段用SalⅠ酶解 ,酶切产物与预计大小完全相符 ;用GUS基因作探针进行Southern杂交和用Km基因作探针对基因组DNA进行Southern杂交 ,均获得较强的杂交信号。 相似文献
8.
为了了解大肠杆菌O157分离菌株携带毒力及黏附相关基因的情况及菌株的多态性.用聚合酶链式反应扩增stx1、stx2、eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因.选用限制性内切酶HincⅡ和EcoRⅡ对分离的O157:H7菌株eaeA基因进行酶切,选用限制性内切酶HaeⅢ、HinfⅠ、EcoRⅡ和RsaⅠ对分离的O157:H7菌株chxA基因进行酶切,最后对这两个基因进行PCR-RFLP分析.结果,所有O157:H7菌株扩增出eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因,但没有扩增出stx1和stx2基因;4株O157:H?菌株,均没有扩增出stx2、eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因,且只有1株扩增出stx1基因.所有分离菌株的eaeA基因和ehxA基因选用限制性内切酶酶切之后所得酶切片段数目和大小与标准菌株的eaeA基因和ehxA基因选用限制性内切酶酶切之后所得酶切片段数目和大小相同.结果表明,由于所有菌株缺失stx2基因,其致病力相对较低,且在基因水平较为保守,多态性较为单一. 相似文献
9.
以国内主要流行的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)QH-1、HN-7菌株的基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增出外膜脂蛋白(OML)基因片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，经酶切和PCR鉴定，对阳性克隆进行序列测定。将测序结果分别与标准菌株进行比较，QH—1株的核苷酸序列与血清1、9、11、12型参考株的同源性达99．1％～99．9％；HN-7株的核苷酸序列与血清7、3、4、6型参考株的同源性达97．3％～100％，与其他血清型参考株的同源性较低。 相似文献
10.
根据GenBank登录的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）非结构蛋白（NS）基因特征,本研究设计1对特异性引物对GPV和MDPV基因组DNA进行PCR扩增,目的片段大小均为810 bp,并对PCR产物进行切胶回收。用EcoRⅠ酶对GPV和MDPV特异性胶回收产物进行酶切鉴定,结果显示MDPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段,大小为530和280 bp;而GPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。本研究建立了一种快速区别GPV和MDPV感染的检测方法,可对番鸭感染水禽细小病毒的情况进行快速鉴别诊断。 相似文献
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本文主要报道了用 3种不同方法从S8黑曲霉菌丝体中提取基因组DNA ,最适方法是经改进的Vitagene试剂盒法。PCR扩增效果最好的是设计时没有去掉phyA基因内含子的引物 ,获得的特异性PCR产物长约 1.5kb。同时对PCR反应体系进行了优化。对扩增出的目的片段用 3种不同方法进行纯化回收 ,结果是PCRFragmentRe coveryKit法回收效果最好 ,其产量可达到约 10ng/ μL。根据已报道的植酸酶phyA基因序列酶切位点 ,对回收的目的片段进行酶切鉴定 ,该基因能被BamHⅠ、SalⅠ酶切 ,不能被HindⅢ、XbalⅠ、KPnⅠ酶切 ,与已知的phyA基因酶切图谱基本一致 ,进一步判定PCR扩增产物中含有植酸酶phyA基因目的片段 相似文献
13.
从采取的新鲜麋鹿血液中提取麋鹿基因组DNA,通过PCR的方法从麋鹿基因组中扩增麋鹿PrP蛋白核心片段的DNA,并分别在引物的5′和3′端引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点,下游引物将原序列TATTAC突变为TAAT从变成两个终止密码子。通过两个酶切位点将麋鹿PrP蛋白核心片段DNA连接到pET-32a（＋）,转化DH5α,通过酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性克隆送菌液测序,从测序结果分析阳性克隆是否符合要求。测序正确后将核心片段基因连接到pET-32a（＋）,阳性质粒命名为MPrP-pET-32a（＋）,阳性质粒转化E.coli BL21（DE3）,进行诱导表达、蛋白质纯化鉴定。 相似文献
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牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达 总被引：4，自引：1，他引：4
以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础. 相似文献
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以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGEX-4T-1原核表达载体,并将纯化的Rv3117基因亚克隆至pGEX-4T-1中,构建出原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3117。将pGEX-4T-1-Rv3117重组质粒转化至感受态E.coli BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30ku目的蛋白带。Western blot分析结果显示,该蛋白能与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。研究结果为结核病临床诊断抗原的筛选奠定了基础。 相似文献
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根据已发表的引物序列合成一对引物,以嗜水气单胞菌J-1株基因组为模板扩增脂酶基因,得到一个保守的383 bp基因片段。进一步应用基因组步移技术扩增其两侧未知序列,分别以DraⅠ,EcoRⅤ,PvuⅡ,ScaⅠ,StuⅠ,SmaⅠ6个内切酶酶切的基因组构建6个不同的基因组步移文库,再以基因组步移文库为模板,设计引物向已获得的保守片段两侧进行PCR扩增,将扩增到的两侧序列与保守片段拼接后得到一个3 476 bp的片段,通过DNA Star软件分析,找到一个2 415 bp的开放阅读框,经Blast软件分析,其与嗜水气单胞菌ATCC 7966脂酶、嗜水气单胞菌AH-3磷脂酶A1、嗜水气单胞菌H3脂酶、嗜水气单胞菌Mcc-2脂酶、嗜水气单胞菌J MP636磷脂酶C的序列同源性分别为97%、97%、88%、83%和82%。将DNA序列翻译成氨基酸序列后,发现其包含一个多肽序列(VHFLGHSLGA),这个序列在脂酶中高度保守。 相似文献
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抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报 总被引：1，自引：1，他引：0
以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础.结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体.获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L.经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中. 相似文献