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以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板，PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc)，酶切及核苷酸序列分析鉴定后，与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接，构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc，转入大肠杆菌B121中，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析发现，转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD，与实际预测相符，命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明：纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因特异片段的克隆和表达 总被引：3，自引：1，他引：3
以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组表达质粒pGEX-apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,25-4株apxIVA gene与基因库中标准7型apxIVA gene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符.apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础. 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25＿4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18＿T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX＿6P＿1中,构建成重组表达质粒pGEX＿apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS＿PAGE电泳。结果表明,25＿4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板，PCR扩增其apfA特异性基因片段，PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达质粒pGEX-apfA，转化到感受态大肠杆菌DE3中，以IPTG进行诱导，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98％，所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000，与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引：4，自引：3，他引：4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5型菌株基因组DNA作为模板成功扩增出特异性基因片段,分别将目的片段克隆入原核表达载体成功构建重组表达质粒pColdI-omp2、pColdI-ApxⅡ、pET-32am-ApxⅠ、pCold-ProS2-ApxⅢ。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞,通过IPTG诱导表达,应用His单克隆抗体和临床阳性猪血清对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析,结果表明表达蛋白的分子量大小与预期相符,通过诱导条件的优化可以稳定表达可溶性蛋白,可溶性蛋白能与His单克隆抗体和临床阳性猪血清发生特异性反应,证明重组蛋白具有良好的免疫反应性。该试验为后期建立胸膜肺炎放线杆菌抗体的ELISA检测方法奠定基础。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
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以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型SC-A株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜脂蛋白(OML)基因特异片段,并克隆于pMD18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pET-32 a(+),成功构建了重组表达载体pET-mOML。以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白(TRX-mOML)分子质量约为60 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,采取非变性电泳方法对蛋白进行纯化,经ELISA检测,重组OML免疫小鼠可产生较高水平的抗OML抗体,这表明重组OML有较好的免疫原性。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达 总被引：6，自引：1，他引：6
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。 相似文献
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本研究应用限制性内切酶MboⅠ消化胸膜肺炎放线杆菌血清7型的基因组DNA，回收500bp～3000bp的片段，插入到真核表达载体pCDNA3．1（＋）的BamHⅠ酶切位点构建重组质粒，电转化大肠杆菌TG1，获得胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库（大约含有10^6个克隆）。将该文库随机分为10个亚文库（10个Clone pool），分别提取每个亚文库的重组质粒免疫小鼠（n=130只），免疫剂量为100μg，免疫3次后以1型胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒，通过相对保护率、肺组织荷菌数、病理组织学3个指标测定其对小鼠的免疫保护作用。试验结果表明，Clone pool3、Clone pool2、Clone pool6和Clone pool7的免疫效果明显优于其他免疫组，尤其是Clone pool3的免疫保护效果最佳。本研究成功构建了7型胸膜肺炎放线杆菌的基因组表达文库，从而为筛选和获得新的保护性抗原基因奠定基础。 相似文献
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合成胸膜肺炎放线杆菌质粒pKMA2425上长度为126bp及2214bp的2个DNA片段,克隆到大肠埃希氏菌质粒pGSI中,获得重组质粒pGSIA。PCR扩增pTKRED上的大观霉素抗性基因及线性化的pGSIA（126bpDNA片段-pGSI-2214bpDNA片段）,连接,电转化胸膜肺炎放线杆菌,在大观霉素的选择压力下筛选鉴定到连接正确的质粒,命名为pGSIAS。pGSIAS测序结果符合预期。在大观霉素的选择压力下,含有pGSIAS的胸膜肺炎放线杆菌血清1-10型菌株均生长良好;在氨苄青霉素的选择压力下,含有pGSIAS的大肠埃希氏菌生长良好。结果表明本研究构建的大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体pGSIAS序列正确,在胸膜肺炎放线杆菌及大肠埃希氏菌中均能复制并表达质粒上的相关基因。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达 总被引：2，自引：1，他引：1
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。 相似文献
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本研究建立了鉴定猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清型的多重PCR方法,并对鲁西地区流行的APP血清型进行了鉴定.根据猪胸膜肺炎放线杆菌的外膜脂蛋白(OmlA)基因设计1对种特异性引物;并且根据血清1型、5型、7型荚膜多(cps)基因设计型特异性引物,建立检测血清1型、5型、7型的PCR方法.运用多重PCR对临床分离鉴定的89株APP进行血清型鉴定,结果表明建立的多重PCR检测方法特异性和敏感性良好,可作为猪传染性胸膜肺炎快速诊断和流行病学调查的重要手段. 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的鉴别诊断及血清型鉴定 总被引：18，自引：0，他引：18
利用PCR技术、琼脂扩散试验、糖发酵试验和间接血凝试验(IHA)对野外分离到的可疑猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌进行了诊断和血清型鉴定.PCR鉴定分离物HS1580为副猪嗜血杆菌,分离物HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌;生化试验表明分离物HS1581和HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌;血清型鉴定分离物HS1580不属于被检的14个血清型之列,HS1581为App血清15型,HS1582为App血清7型.试验结果表明,综合使用PCR等技术可快速、准确地对这两种传染性细菌进行鉴别诊断和血清型鉴定. 相似文献
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本研究以自杀性质粒pUT携带含有信号标签的Mini-Tn5转座子对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌进行转座诱变,构建了带有12对特异性信号标签的Mini-Tn5转座子的pUT自杀质粒,转化到供体菌E.coliβ2155后,利用双亲本滤膜杂交法与受体猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌(APP1)进行接合转移,构建并优化了接合转移体系.利用抗性和营养缺陷培养平板筛选得到接合突变体,通过抗性通用引物与12个特异标签引物和胸膜肺炎放线杆菌毒素IV(ApxIV)鉴定引物分别对这些突变体进行了PCR鉴定和测序验证.结果表明,经过加入标签的MinI-Tn5转座子可以通过接合转移的方式从供体菌E.COliβ2155中插入到APP1基因组当中,并成功构建了12个含有特异信号标签的重组质粒,获得了APP1的12个转座突变体库,经筛选鉴定后得到561个突变株.这为研究APP1的功能基因和筛选特定突变株提供了必要的基础. 相似文献