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1.
共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒的构建及其在小鼠模型上的免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组腺病毒疫苗。首先利用重叠PCR将GP5和E2基因通过口蹄疫病毒(FMDV)2A序列连接,形成一个完整的ORF,并将其克隆到腺病毒穿梭载体中,通过细菌内同源重组构建共表达PRRSVGP5蛋白和CSFVE2蛋白的重组腺病毒(rAdV-GP52AE2)。间接免疫荧光试验和western blot检测证实2个外源基因均获得表达。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,rAdV-GP52AE2免疫组针对CSFV的中和抗体滴度可达1∶128,针对PRRSV的中和抗体滴度为1∶16;在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。这些结果显示,利用具有自动剪切功能的FMDV2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。 相似文献
2.
《中国兽医学报》2016,(9):1537-1543
构建O型口蹄疫病毒抗原表位VP1的重组腺病毒载体,并在体外和体内培养试验中检测腺病毒介导VP1的表达。利用PCR技术,从原始质粒中扩增VP1基因片段,双酶切后连接载体构建重组穿梭质粒pHBAd-MCMVVP1-GFP,并经磷酸钙沉淀法携带骨架质粒按比例转染HEK293A细胞,获得P1代腺病毒颗粒,经多轮扩增后进行浓缩纯化,获得复制缺陷型腺病毒颗粒,测定病毒滴度。进行体外感染乳腺上皮细胞,通过GFP的荧光表达量确定最佳感染复数。然后用RT-PCR和Western blotting检测感染的乳腺上皮细胞中抗原表位VP1的表达。进一步用纯化的腺病毒通过乳头滴定法感染羊乳腺组织,检测其乳汁中VP1的表达。结果显示,PCR、双酶切和基因测序等结果表明基因扩增和腺病毒载体构建正确,以其感染关中奶山羊乳腺上皮细胞和乳腺组织时,均可检测到VP1蛋白表达。结果表明,成功构建了含VP1基因的重组腺病毒载体,且能够介导VP1基因在体外和体内培养试验中有效表达,为进一步研究纯化分离的VP1蛋白的抗原性并提高抗原优化技术提供基础研究。 相似文献
3.
表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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构建表达基孔肯雅病毒E1蛋白的重组腺病毒,鉴定该重组腺病毒,并对该重组腺病毒的稳定性进行研究。本研究通过构建重组腺病毒穿梭质粒Ad5-EGFP-CHIKV-E1,将质粒Ad5-EGFP-CHIKV-E1与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞获得重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1,并通过Western blot与PCR方法鉴定E1基因表达的稳定性。PCR鉴定结果表明重组腺病毒可扩增1323bp大小的条带;经Western blot鉴定重组腺病毒可表达大小为52 000的E1蛋白。结果表明,重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1可以成功表达基孔肯雅病毒E1基因;提取第0,2,4,6,8,10,12,14,16代重组腺病毒基因组,经PCR鉴定证实重组腺病毒在16代内稳定性良好。成功构建出表达基孔肯雅病毒E1基因的重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1,该病毒可以稳定表达,为研发基孔肯雅病毒疫苗奠定基础。 相似文献
5.
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5,经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因。经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达。体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性。本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
6.
基因工程疫苗即利用DNA重组技术，将病原的保护性抗原编码基因片段定向插入载体或表达系统中，使之能够实现体内或体外的高效表达进而制成疫苗，如亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺失疫苗和核酸疫苗等。相较于传统疫苗，基因工程疫苗能不断刺激机体免疫系统产生长期免疫；避免因病原体变异而造成免疫逃避；一个质粒载体可克隆多个抗原基因组成多价疫苗，提高了疾病的防治效率和效果，是未来的主要发展和研究方向之一。文章对基因工程疫苗在兽医领域的研究进展进行了概述，旨在为相应研究与实践提供一定参考。 相似文献
7.
《中国兽医学报》2017,(2):254-257
PCR扩增牛源犬新孢子虫NcAMA1基因,克隆至pMD18-T simple载体;将鉴定正确的NcAMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1;依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,构建NcAMA1基因重组腺病毒表达质粒T294-NcAMA1;PacⅠ酶线性化后,脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞,包装Ad5-NcAMA1重组腺病毒。结果表明,获得Ad5-NcAMA1重组腺病毒滴度为5.6×109 TCID50/mL;经PCR检测到重组腺病毒NcAMA1基因;经IFAT和Western blot检测NcAMA1基因在QBIHEK293细胞中获得表达,表达蛋白相对分子质量为68 000,具有较好的反应原性。本试验成功构建了Ad5-NcAMA1重组腺病毒,为牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定基础。 相似文献
8.
根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内.含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌.利用细菌内同源重组法得到重组腺病毒质粒(pAd-PAC).在Lipofectamine2000介导下重组腺病毒质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒(Ad-PAC).半数组织培养感染剂量(TCID_(50))测定、免疫荧光试验(IFA)和连续传代后目的基因的PCR扩增,证实重组病毒滴度为10~(5.5) TCID_(50)/0.1 mL,重组病毒HEK293细胞中得以表达且遗传稳定性良好;动物试验表明,该重组病毒能够诱导小鼠产生较高水平的针对口蹄疫病毒的特异性抗体;本试验为口蹄疫重组腺病毒活载体疫苗的进一步研究和应用奠定了基础. 相似文献
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将携带狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因的穿梭栽体pShuttle-G和pShuttle-dG分别经PmeⅠ线性化后电转化含E1和E3区缺失的人5型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态菌株BJ5183-AD-1进行细菌内同源重组,经抗性筛选,PcR、PacⅠ酶切及测序鉴定.构建了狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因重组腺病毒质粒pAdHu5-G和pAdHu5-dG,线性化后分别转染Ad-293细胞进行病毒包装.结果显示,在第4天发生细胞病变效应,且荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达;western-blot证实2株重组腺病毒表达的糖蛋白能被特异性单抗识别;遗传稳定性分析显示,病毒传至10代时单G和双G基因均稳定遗传,没有发生缺失和突变.为比较分析2株重组腺病毒糖蛋白的表达时效及免疫效果奠定了基础. 相似文献
10.
《动物医学进展》2015,(7)
构建以多层纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒基因重组疫苗。在GenBank中查询编码O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1 141-160氨基酸和VP2 1-33氨基酸的核苷酸序列,合成该两段基因的重组基因并命名为VP1-VP2基因。再通过PCR扩增VP1和VP2基因,并将VP1、VP2及VP1-VP2基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1中,构建3种重组真核表达质粒(pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP1-VP2),并分别对重组质粒进行酶切、PCR鉴定及测序分析。将构建的重组质粒制备成多层磷酸钙纳米颗粒,检测其粒径、稳定性及体外转染效率。重组质粒酶切结果显示,基因片段大小与预期相符;测序显示与GenBank中相应基因序列同源性为100%。制备的多层纳米颗粒粒径约为530nm;在4℃过夜保存后,溶液均匀透明;体外转染HEK293细胞的转染效率在9.6%左右。成功构建了以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组质粒,为进一步研究该基因疫苗奠定了基础。 相似文献
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12.
Adenovirus-mediated gene delivery of anticytokines is a powerful tool for modulating the cytokine environment under conditions of respiratory disease. In order to determine the feasibility of cytokine modulation in the context of respiratory disease in swine, nonreplicating E1- and E3-deficient adenovirus constructs expressing a model protein, beta-galactosidase, and an anticytokine, the IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra), were evaluated for in vitro expression in porcine PK15 cells, and in vivo following endotracheal instillation into the lungs. beta-Galactosidase and IL-1Ra were readily expressed in vitro in swine cells. Endotracheal administration of lacZ-containing adenovirus demonstrated that endothelial and epithelial cells in the alveolar spaces and bronchi of the middle and lower lobes were the principal sites of infection and expression, whereas beta-galactosidase staining was not observed in the upper lobe. Endotracheal administration of IL-1Ra recombinant adenovirus resulted in sustained expression of IL-1Ra into the alveolar spaces, where it was recovered in a concentration of 660 pg/ml in 500 ml of lavage fluid, equivalent to 330 ng IL-1Ra, in the lungs 7 days after treatment. Moreover, in vivo instillation of nonreplicating adenovirus did not induce an inflammatory response in the 1-week time frame of the study period. Lung weight as a percent of body weight, serum zinc, serum amyloid A, leukocyte differentials, neutrophil activity, and TNF levels all were the same between untreated pigs and pigs treated with either recombinant adenovirus. The results indicate that the delivery of IL-1Ra to swine lungs via nonreplicating, recombinant adenovirus may be an effective method for in vivo modulation of IL-1 activity and investigation of cytokine involvement in respiratory disease pathogenesis. 相似文献
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本研究通过构建腺病毒介导的体外超表达载体，探究腺苷甲硫氨酸转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）基因在猪肌内脂肪细胞分化中的作用。根据GenBank中猪MAT2A基因mRNA序列（登录号：NM_001167650.1）设计引物，提取猪脂肪组织细胞总RNA并反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增并连接到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中，对重组质粒pAd-MAT2A进行测序鉴定；pAd-MAT2A载体经PacⅠ限制酶酶切线性化，经质粒大片段回收纯化后转染293A细胞进行病毒包装；采用实时荧光定量PCR检测MAT2A基因表达情况，并提取蛋白进行Western blotting分析，取分化第8天的细胞进行油红O染色。结果表明，穿梭载体pAdTrack-CMV-MAT2A构建成功，并能与骨架载体pAdEasy-1实现同源重组；腺病毒载体pAd-MAT2A转染293A细胞后，病毒滴度达到1E+6 PFU/mL，可满足侵染猪肌内脂肪细胞的需要。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，MAT2A基因mRNA和蛋白水平均显著上调。油红O染色结果显示，过表达MAT2A基因可促进猪肌内脂肪细胞内脂滴聚积。结果表明，腺病毒介导的MAT2A基因过表达在猪肌内脂肪细胞中呈上调趋势，MAT2A基因可促进脂质积累。 相似文献
14.
基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。由于病毒型载体存在安全性问题,目前非病毒性载体的研究越来越受到人们的重视。非病毒载体是新兴的基因转导系统,具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无基因插入片断大小限制,以及使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势。脂质体作为常用的非病毒性载体容易制备,安全性高,却难达到质控要求,体内基因导入效率低,且无靶向性,使得其应用受到限制。pH一敏脂质体、阳离子脂质体等大大提高了脂质体的转运效率。同时高分子载体、纳米基因转运体在基因治疗中的应用,也为非病毒载体在临床上的应用开辟了广阔的前景。 相似文献
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为了构建叉头框L2(Forkhead box L2,FOXL2)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因复制缺陷型腺病毒载体,试验将克隆的FOXL2基因与IRES-GFP片段通过酶切、纯化等方法共同连接到pShuttle-CMV载体中,再与pAdEasy-1腺病毒质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到复制缺陷型AD-FOXL2腺病毒载体,再用PacⅠ酶线性化后转染HEK293细胞,观察绿色荧光表达,并测量病毒效价。结果表明:将AD-FOXL2腺病毒载体用PacⅠ酶线性化后,得到1个大于23 kb的大片段和1个4.5 kb的特异性小片段,证明同源重组成功;将所得的腺病毒载体转染HEK293细胞,可以观察到GFP的表达,证明包装成功,并测得病毒效价为1×10-8.61/0.1 mLTCID50。 相似文献
16.
动物腺病毒载体的研究进展 总被引：4，自引：2，他引：2
腺病毒载体已成为近年来在基因治疗和重组疫苗研究方面的热点 ,文章较详细地叙述了腺病毒载体的构建基础、腺病毒载体的构建方法和各类动物腺病毒载体的研究现状以及腺病毒载体在应用时遇到的免疫学问题。并依据现有的腺病毒活载体的研究现状 ,讨论了动物腺病毒载体的发展趋势 ,提出在人类腺病毒载体应用遇到的免疫学问题上 ,某些动物腺病毒载体将具有独特的潜力 相似文献
17.
N. Kanaya M. Yazawa M. Mochizuki R. Nishimura N. Sasaki A. Setoguchi K. Ohno H. Tsujimoto 《Veterinary and comparative oncology》2005,3(1):45-46
Introduction: It has been reported that 40–50% of canine osteosarcoma cases have p53 mutations. The p53 tumor supressor gene plays a central role in cell cycle regulation and induction of apoptosis. We previously showed that adenoviral vector expressing canine P53 (AxCA‐cp53) inhibited growth of cultured canine osteosarcoma cell lines. Here, we evaluated anti‐tumor effect of adenovirus‐mediated p53 gene therapy on the growth of canine osteosarcomas transplanted into nude mice.
Methods: Nine nude mice were subcutaneously injected with cells of a canine osteosarcoma cell line (POS) having p53 gene mutation. The transplanted tumors formed into nude mice were injected with AxCA‐cp53, AxCA‐LacZ (adenovirus vector expressing LacZ) or PBS (3 mice each) 7 times during 15 days. Tumor sizes were measured every 3 days for 27 days after injection with the adenovirus vectors. Expression efficiency of the adenovirus‐mediated gene transfer was examined by X‐gal staining and P53 immunostaining. Effects of the P53 expression on cell cycle control were examined by RT‐PCR for expression of p21 gene downstream of P53.
Results: Significant differences in the tumor size was observed between the transplanted osteosarcoma tissues injected with AxCA‐cp53 and those injected with AxCA‐LacZ or PBS. Expressions of LacZ and P53 were confirmed at the injection sites of the tumors. Moreover, p21 mRNA expression was shown to be induced in the AxCA‐cp53‐injected tumors, indicating the funciton of P53 to induce cell cycle arrest.
Conclusions: Adenoviral vector expressing canine P53 inhibited the growth of canine ostersarcoma transplanted into nude mice. 相似文献
Methods: Nine nude mice were subcutaneously injected with cells of a canine osteosarcoma cell line (POS) having p53 gene mutation. The transplanted tumors formed into nude mice were injected with AxCA‐cp53, AxCA‐LacZ (adenovirus vector expressing LacZ) or PBS (3 mice each) 7 times during 15 days. Tumor sizes were measured every 3 days for 27 days after injection with the adenovirus vectors. Expression efficiency of the adenovirus‐mediated gene transfer was examined by X‐gal staining and P53 immunostaining. Effects of the P53 expression on cell cycle control were examined by RT‐PCR for expression of p21 gene downstream of P53.
Results: Significant differences in the tumor size was observed between the transplanted osteosarcoma tissues injected with AxCA‐cp53 and those injected with AxCA‐LacZ or PBS. Expressions of LacZ and P53 were confirmed at the injection sites of the tumors. Moreover, p21 mRNA expression was shown to be induced in the AxCA‐cp53‐injected tumors, indicating the funciton of P53 to induce cell cycle arrest.
Conclusions: Adenoviral vector expressing canine P53 inhibited the growth of canine ostersarcoma transplanted into nude mice. 相似文献
18.
本研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为研究其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达以及功能和作用机制做准备。根据GenBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasyⅠ的E.coli Bj5183感受态细胞进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-MAT-HIS,并用PacⅠ酶切鉴定,将经过PacⅠ线性化的pAd-MAT-HIS转染HEK 293细胞进行病毒包装和扩增,用LaSRT法测定病毒滴度。将本次克隆的MAT序列与GenBank收录的山羊序列对比发现,在601bp处碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由丙氨酸(Ala)201转变为苏氨酸(Thr)201。酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察、PCR及Western blot检测均证明,重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为2×109 PFU.mL-1。本研究成功构建了重组腺病毒pAdEasy-MAT-HIS。 相似文献
19.
为研究CRISPR/Cas9腺病毒载体在鸡胚中进行基因敲入的可行性,将包装不同滴度增强型绿色荧光报道基因(Enhance green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体和慢病毒载体显微注射到HH14时期鸡胚的外周血管中,对胚胎发育至3.5 d和9 d鸡胚存活、各器官中EGFP荧光强度等指标进行检测;将包装CRISPR/Cas9系统的腺病毒载体和Donor片段的腺病毒载体共同显微注射到鸡胚后,对成年公鸡各器官中EGFP荧光长期表达、EGFP基因敲入等指标进行检测。结果显示:两种病毒载体对鸡胚心脏和性腺的转染效率呈现显著的滴度依赖性,但1×1011TU/mL的EGFP腺病毒载体将9 d鸡胚存活率从93.18%显著降低至64.11%(P<0.05);选择滴度为1×1010TU/mL的CRISPR/Cas9腺病毒和Donor腺病毒载体进行EGFP的基因敲入,注射后成年公鸡多个组织均能稳定表达绿色荧光,PCR检测证明该荧光来自EGFP的基因敲入。研究提示:腺病毒载体比慢病毒载体具有更高的鸡胚转染效率,使用CRISPR/Cas9腺病毒载体可以在鸡胚中实现高效的EGFP基因敲入。 相似文献