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1.
奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究旨在表达、纯化奶牛早孕因子重组蛋白及制备多克隆抗体.本试验构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的早孕因子重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对重组蛋白及抗体进行检测.结果显示,成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,重组蛋白分子质量约37 ku,表达量约占菌体总蛋白的48.6%,纯化后目的蛋白纯度可达93%,重组蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1:12 800.结果表明,本研究成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,为研究奶牛早孕诊断奠定基础. 相似文献
2.
为表达鸡干扰素调节因子7蛋白并制备其多克隆抗体,通过RT-PCR技术扩增chIRF7基因的编码序列,构建重组质粒PET30a-chIRF7。将重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rchIRF7分子量约为60ku。将纯化的重组蛋白免疫接种小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA测定血清抗体滴度在1∶51 200以上,IFA检测结果显示制备的鼠抗chIRF7蛋白多抗能够与AIV刺激的CEF细胞内的chIRF7蛋白发生特异性反应,表明通过原核表达系统表达的重组蛋白rchIRF7具有很好的免疫原性,以其制备的鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体滴度高、特异性好。 相似文献
3.
通过大肠杆菌表达系统表达补体C9重组蛋白,并制备其多克隆抗体,用于检测沉积菌体表面的补体C9分子;方法:通过PCR以兔肝细胞cDNA文库为模板扩增获得补体C9部分基因,并将其克隆至原核表达载体pEASY.-Blunt E1,经测序鉴定成功获得重组质粒pBlunt-C9。将其转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析柱纯化后,获得重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备抗C9的鼠源多克隆抗体。结果显示,ELISA测得鼠抗C9多克隆抗体效价为1∶12800,Western Blotting表明,制备的多克隆抗体可以特异性识别沉积在金黄色葡萄球菌和链球菌表面的C9分子,为进一步研究补体的生物学功能以及巩膜复合体(MAC)抗细菌感染机制奠定了基础。 相似文献
4.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(11)
HBK鸭是国家禽类实验动物种子中心培育的我国首个无特定病原体(SPF)鸭,已封闭饲养9个世代。鸭抗原处理相关转运体(TAP)基因位于主要组织相容性复合体区域,TAP1和TAP2组成的二聚体具有将抗原肽从细胞质转运入内质网腔的重要作用。为了表达鸭抗原相关转运体蛋白,并制备特异性多克隆抗体,试验采用PCR方法扩增HBKB系鸭的TAP1完整基因和TAP2基因的预测肽结合区(PBD),分别命名为TAP1和TAP2PBD,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒p ET-TAP1和p ET-TAP2PBD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDSPAGE及Western-blot鉴定,表达产物经SDS-PAGE后分别切胶免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明:两种目的蛋白均获得了正确表达。说明试验制备了高特异性鸭TAP1和TAP2多克隆抗体,可用于水禽TAP的结构和功能研究。 相似文献
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本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。 相似文献
6.
旨在筛选和鉴定与鸭补体调节因子Vitronectin(Vn)结合的鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)外膜蛋白。在酵母表达鸭Vn及间接免疫荧光和免疫斑点杂交试验检测鸭疫里默杆菌结合Vn的基础上，以重组Vn为诱饵蛋白进行His pull-down及LC-MS/MS质谱鉴定，筛选外膜蛋白并进行生物信息学分析；原核表达候选外膜蛋白及截短片段，制备多克隆抗体，利用Far-Western blot验证与鸭Vn结合，并用间接ELISA测定肝素和氯化钠对结合的影响；测定Vn及抗外膜蛋白抗体对血清杀菌活性的影响。结果显示，鸭疫里默杆菌能在体外结合鸭Vn,经His-pull down、质谱鉴定及蛋白质结构分析，筛选出的外膜蛋白Omp45具有β桶状结构及7个暴露于细胞膜外的多肽环；成功原核表达Omp45及截短片段，制备的抗Omp45多克隆抗体间接ELISA效价超过1∶12 800,Western blot检测多克隆抗体可以与重组蛋白发生特异性反应；Far-Western blot及间接ELISA结果显示，Omp45、包含2个及以上细胞膜外多肽环的... 相似文献
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《中国畜牧兽医》2018,(11)
为表达H6N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列(登录号:MG434500)设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380bp,可编码459个氨基酸,其中175-207bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 380bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。 相似文献
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禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。 相似文献
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克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。 相似文献
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为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。 相似文献
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在青藏高原高寒草地不同放牧强度区设4个试验样地,分别为原生草甸(NM)、轻度退化草甸(LM)、中度退化草甸(MM)和重度退化草甸(HM),监测草地温室气体通量。结果表明:不同放牧强度对草地温室气体通量影响显著,放牧活动对高寒草甸的影响首先表现在植被上,而土壤环境的变化比较迟滞。通过逐步回归分析和因子拆分得知,草甸甲烷通量影响较大的环境因素为土壤紧实度和有机质,分别能解释44.6%和28.4%的总变异,CO2通量影响较大的环境因素为紧实度和生物量,分别能解释36.1%和32.8%的总变异,氧化亚氮通量影响较大的环境要素为紧实度和有机质,分别能解释50.1%和22.9%的总变异,家畜的践踏作用使退化草地紧实度增加,进而引起温室气体通量的改变,高寒草甸退化演替发展到重度退化阶段时释放大量温室气体。 相似文献
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旨在研究细菌脂多糖(LPS)急性暴露对小鼠睾丸及其功能的影响。将健康雄性小鼠随机分为4组:对照组(Control)、1.25 mg·kg-1 LPS组、2.5 mg·kg-1 LPS组和5.0 mg·kg-1 LPS组,对照组腹腔注射200μL生理盐水,其余3组注射等体积含不同剂量的LPS,作用12 h。收集睾丸组织制作石蜡切片,染色后观察其病理变化,记录体重、睾丸和附睾指数,并测定精子品质相关指标,用RT-qPCR法检测炎症相关基因TNF-α、IL-6、GAS6和TGF-β1的转录,同时用ELISA检测血清中睾酮(T)的含量。结果表明,与对照组相比,LPS急性暴露时,以剂量依赖性方式降低小鼠体重(P<0.05或P<0.01),同时显著降低睾丸指数(P<0.05或P<0.01)、精子密度(P<0.01)及精子活力(P<0.05或P<0.01),增加精子畸形率(P<0.05或P<0.01);使睾丸组织发生不同程度的病理学变化,表现在生精细胞凋亡,曲细精管管腔增大,精子数量减少等;导致血清中睾酮(T)的含量显著下降;另外,LPS还呈剂量依赖方式增加促炎因子TNF-α和IL-6及抑制抗炎因子GAS6和TGF-β1的转录。结果提示,细菌LPS急性暴露可通过破坏机体中炎症因子的平衡,使睾丸组织受到损伤从而导致生精障碍。 相似文献
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从蒲公英根(Taraxacum root)中提取植物多糖(TRP),并探究其对脂多糖(LPS)引起小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)细胞炎症模型的抗炎作用。采用MTT法检测不同浓度(50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL)多糖提取物对细胞的毒性作用。Griess法检测一氧化氮(NO)的分泌量,反转录-聚合酶链反应(PCR)检测细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA转录水平。结果表明,TRP在50μg/mL～200μg/mL的剂量范围内对RAW264.7细胞无明显细胞毒作用,TRP可以显著抑制小鼠单核巨噬细胞NO的分泌,且IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量下调。结果表明,TRP具有一定的体外抗炎作用,体外抗炎效果与质量浓度呈现出剂量依赖关系。 相似文献
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为比较我国不同地区发病鸡源大肠杆菌的致病类型、毒力因子差异和其耐药状况,探讨大肠杆菌对家禽生产和公共卫生的影响,对从山东、西藏等7个省(自治区)的发病鸡群分离获得的130株大肠杆菌菌株,用PCR方法进行了肠致病性大肠杆菌、肠毒素型大肠杆菌等5种致病类型检测和ompT、stx2等7种毒力因子检测,并用15种药物测其耐药性。结果发现,仅5株发病鸡源大肠杆菌为致病性大肠杆菌(3.85%,5/130),且均为肠产毒性大肠杆菌(ETEC)。130株大肠杆菌检测出iroN毒力因子检出率最高(69.23%,90/130),stx2最低(1.54%,2/130),其余均在50%~60%。分离菌株对四环素和氨苄西林耐药率最高,分别为91.54%(119/130)、90.77%(118/130),对美罗培南耐药率最低(12.31%,16/130);多重耐药严重,94.62%(123/130)的菌株对三类或三类以上的药物耐药。本研究通过比较不同地区养鸡场大肠杆菌的致病性和耐药情况,以进一步做好大肠杆菌病的防控。 相似文献
16.
MYB家族转录因子在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥着重要功能。前期研究发现强旱生植物霸王转录因子ZxMYB315参与到植物抗逆过程中,其在拟南芥中的同源基因MYB40的两种不同可变剪接体MYB40.1和MYB40.2对盐胁迫均有明显响应,但其在植物抗逆过程中的功能还未见报道。分析了在盐处理条件下MYB40.1及MYB40.2的表达模式,并利用CRISPR/Cas9技术,获得了2个MYB40.1被编辑株系,及3个MYB40.1和MYB40.2被同时编辑株系,为揭示MYB40这两种可变剪接体在拟南芥响应逆境胁迫过程中的功能和分子机理奠定了基础。 相似文献
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试验比较了水提和碱水提、分步醇沉和分级醇沉提取刺五加多糖的工艺差异。采用水提醇沉的方法提取、分离刺五加多糖,采用Segav法脱蛋白,苯酚-硫酸法测定总糖含量,柱前衍生化GC-MS法测单糖组成。结果显示,水提法的多糖得率较高,但是总糖含量较低;碱提法的多糖得率略低,但是总糖含量较高;分步醇沉操作繁琐,但是多糖得率和总糖含量最高。提取溶剂和醇沉浓度不同,单糖组成比例有所变化。木糖和半乳糖在刺五加多糖中比例高于阿拉伯糖和葡萄糖比例。综合考虑,用碱水提取刺五加多糖,采用分步醇沉的方法,可以得到较多和较高含量的多糖。 相似文献
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试验旨在研究日粮中添加不同锰源对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋壳颜色的影响。试验1在基础日粮(不含锰)中分别添加60、80、100、125 mg/kg硫酸锰(以锰计),125 mg/kg硫酸锰组蛋鸡蛋重显著高于其他组(P<0.05),100、125 mg/kg组蛋壳颜色指数显著好于60、80 mg/kg组;试验2(基于试验1的试验结果),在基础日粮中,试验组分别添加125 mg/kg硫酸锰、100 mg/kg硫酸锰+25 mg/kg甘氨酸锰、80 mg/kg硫酸锰+45 mg/kg甘氨酸锰(以锰计)。试验结果表明:有机锰组合对改善产蛋鸡后期生产性能无显著影响,蛋壳颜色指数也无显著影响(P>0.05),但有提高蛋壳颜色指数的趋势。 相似文献
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贵州威宁地区栽培草地的建植常以鸭茅(Dactylis glomerate)和白三叶(Trifolium repens)为主,通过在建植均匀的草地上进行分群分区放牧,研究了不同羊群的放牧强度对人工栽培草地植被和土壤特征的影响。结果表明:高强度放牧利用下的群落高度和地上生物量显著降低(P<0.05),而低度和中度放牧处理下的群落高度和生物量均没有显著性变化(P>0.05);放牧利用降低了鸭茅和白三叶的频度和盖度;放牧利用对表层土壤容重的影响不显著(P>0.05),但是在高放牧压力处理中,10~30cm土层土壤容重比其他处理平均升高32%;放牧对土壤化学性质有显著影响(P<0.05),随着放牧强度的增加,土壤养分含量呈下降趋势。综合草产量和草地恢复能力分析,贵州威宁地区的栽培草地最适载畜量应该在17~23SU/hm^2。 相似文献
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为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验。采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60%的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料。 相似文献