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1.
根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏菌(Brucella.spp)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 相似文献
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为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
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为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法，本试验以EHV-8的全基因组序列为模板，针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列，进行对比分析，设计EHV-8的特异性引物和探针，优化反应条件，建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证，使用该方法进行临床样本检测。结果显示，建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×102 copies/μL,敏感性高；EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应，特异性强；批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示，阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见，本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求，且该方法敏感性高、特异性强、重复性好，为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。 相似文献
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根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 相似文献
6.
根据虎线粒体细胞色素b核苷酸保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定虎制品的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,5.0×105~ 5.0×101拷贝/μL范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝/μL。对豹、狮子、猫等7种非虎哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在虎制品的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(4):572-578
山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。 相似文献
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《中国家禽》2017,(20)
研究旨在建立一种适用于鸭坦布苏病毒检测的荧光定量Taq Man RT-PCR技术。以JXSP株RNA为模板,建立检测鸭坦布苏病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。制备含有上述目的片段的RNA作为标准品,10倍比稀释后建立标准曲线,测定敏感性。同时采用标准品对该方法的批内和批间重复性进行检测,并与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测。结果:建立的荧光定量Taq Man RT-PCR方法能在鸭坦布苏病毒JXSP株RNA样本中检出荧光信号。最低检出量为2.06×10~1拷贝/反应;线性范围达9个数量级。该方法重复性良好,批内变异系数不足0.4%;批间变异系数不足2.2%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,经体外感染细胞培养物及临床样品检测证实,该方法可实时反映病毒液中的病毒含量,可在获得样品后3 h以内得到检测结果,可用于临床样品中鸭坦布苏病毒的快速检测。 相似文献
9.
《中国兽医学报》2020,(5)
建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。 相似文献
10.
用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。 相似文献
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布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。 相似文献
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根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157∶H7快速定量检测的实时定量PCR方法。该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍。方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157∶H7,对非大肠杆菌O157∶H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应。利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157∶H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。 相似文献
14.
根据GenBank中猪伪狂犬病病毒（PRV）gE基因的序列（EF552427）,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9999,最低检测的拷贝数为35.4拷贝/25μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点。本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。 相似文献
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牛副结核分枝杆菌实时荧光定量 PCR 检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因保守区域序列设计合成1对特异性引物,建立了一套SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测牛副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)的方法。以实验室构建的牛副结核分枝杆菌pMD-ISMav2阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线,其相关系数为0.999。以构建的标准品为模板,进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法检测布氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌DNA均为阴性;最低可检测到相当于每微升1.96×101拷贝数的标准品阳性质粒。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感和快速等优点,可用于牛副结核杆菌病的监测。 相似文献
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Primers were designed based on insert sequence IS1111 of Coxiella bumetii of Q fever, SYBR GreenⅠReal-time quantitative PCR assay was developed for indentification of Q fever. The recombinant plasmid containing the target sequence was constructed to detect the sensitivity and prepare the standard curve. The method could detect 102 of the plasmid copy numbers.Related coefficient was 0.991 of the standard curve,the amplification efficiency was 98%.The results of specific detection of nucleic acid sample for M.tuberculosis,Chlamydia,Brucella and bovine blood were negative. SYBR GreenⅠfluorescent quantitative PCR method developed in this study had high Brucella sensitivity and specificity,and could be used for clinical test. 相似文献
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实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中鸭源性成分 总被引：3，自引：0，他引：3
根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。 相似文献
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非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、Mg2＋浓度和引物、探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60 ℃,Mg2＋终浓度为4 mmol/L,引物、探针终浓度分别为0.8、0.3 μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝/μL的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。 相似文献