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1.
《畜牧与兽医》2021,(8)
伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)属于甲型疱疹病毒亚科水痘病毒属,其基因组约为150 kb,可分为独特长区、内部重复序列、独特短区以及末端重复序列。PRV US3基因位于其基因组的独特短区,属于复制非必须基因,是病毒的重要毒力基因,编码产物是丝/苏氨酸激酶。US3基因编码蛋白是一种多功能蛋白,可参与PRV逃避宿主免疫清除,抑制病毒介导的细胞凋亡,影响病毒粒子在细胞核质中的运输,调动感染细胞肌动蛋白骨架重排,诱导宿主细胞形态改变进而增强PRV在细胞中的传播能力,在病毒生命周期的多个阶段发挥作用。本文综述了PRV US3编码蛋白功能的研究进展,为PRV致病机制的研究提供了参考。 相似文献
2.
旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)感染后细胞自噬和凋亡情况,进一步分析鉴定PRV感染条件下与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白。利用免疫印迹(WB)方法检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术探讨凋亡水平;最后利用免疫共沉淀试验分析PRV感染PK-15细胞中Beclin1与Bcl-2和Bcl-xL的结合水平。结果显示,PRV感染导致LC3-Ⅱ的表达明显增多,而P62显著下降,且AKT(S473)磷酸化水平显著减少;其次,PRV感染诱导细胞凋亡且显著上调剪切型Caspase-9/8的表达水平;最后,免疫共沉淀结果显示PRV感染条件下Beclin1能与Bcl-2和Bcl-xL结合,但结合的水平明显降低。PRV感染诱导的细胞自噬可能依赖于PI3K-Ⅰ/AKT信号通路,PRV感染可能同时激活了线粒体凋亡途经和死亡受体途经从而诱导细胞凋亡,而PRV感染诱导的细胞自噬和细胞凋亡可能通过抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL结合而相互关联。 相似文献
3.
旨在筛选并鉴定与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)相互作用的宿主蛋白。本试验通过构建猪肺酵母cDNA文库、酵母双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦、过表达和干扰试验等手段,筛选与N蛋白互作的宿主蛋白并研究其对PRRSV复制的影响。结果显示：N蛋白和核糖体蛋白S20(RPS20)在酵母细胞内发生互作,免疫共沉淀和激光共聚焦试验进一步确定N蛋白和RPS20蛋白互作并共定位于细胞质中。过表达和干扰试验证实RPS20能够影响HP-PRRSV在细胞内的增殖。本研究丰富了PRRSV与宿主因子互作的网络,为进一步研究RPS20蛋白在PRRSV感染过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
4.
本试验旨在利用TMT蛋白组学分析并筛选出抑制伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)复制的关键宿主蛋白。前期通过TMT定量蛋白组学技术筛选出241个差异蛋白，Western blot和RT-qPCR验证4个差异表达的蛋白，结果与蛋白组学结果一致，表明蛋白组学结果真实可信。通过构建4个差异表达蛋白的真核表达载体，Western blot、RT-qPCR、病毒噬斑结果显示这4个宿主蛋白均可抑制PRV的复制；然后通过双荧光素报告基因检测IFN-β启动子活性，结果显示，MCCC1、STRAP促进IFN-β启动子活性效果更为显著；针对MCCC1和STRAP设计siRNA,Western blot和病毒噬斑结果显示，敲低STRAP显著促进PRV的复制。本试验最终筛选出显著影响PRV复制的宿主蛋白STRAP,为研究PRV与宿主互作的分子机制奠定基础。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2017,(6):1018-1022
为了研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞后宿主蛋白的差异表达情况,寻找PRV与细胞相互作用的重要分子,本试验将PRV接种PK-15细胞,运用同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合色谱/串联质谱联用技术,开展病毒感染细胞后差异表达蛋白分析,并通过qPCR对其数据进行验证。以未接毒细胞为对照,通过数据库检索,分析出3 062个蛋白,共鉴定到27个差异表达蛋白,其中21个蛋白下调,6个蛋白上调。这些差异蛋白主要参与代谢过程、生物调控、应激反应以及定位等生物学过程,具有结合活性、催化活性、转录活性等分子功能。NFκB1、PIK3R2、HSPA1L等差异蛋白在多条通路中发挥作用。POP1、UTP15和ND4的表达变化情况与iTRAQ结果变化趋势一致,证明了该数据的可靠性。本试验研究结果为进一步研究PRV致病机制及宿主免疫应答提供理论依据。 相似文献
6.
研究鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)σC蛋白与宿主因子之间的相互作用,对揭示σC蛋白在病毒复制过程中的功能及该病毒的致病机理具有重要作用。本研究采用免疫共沉淀法及质谱分析技术,筛选出与σC蛋白可能发生互作的宿主相关蛋白,并对所筛选出的宿主细胞蛋白进行了GO注释和KEGG代谢通路注释。结果表明,与空白对照组比较,获得与σC蛋白相互作用的宿主细胞蛋白有100个;筛选出的这些宿主细胞蛋白中,在病毒感染后不同时间点差异表达量均上升3倍以上的蛋白有6个,分别与病原致病性、蛋白质代谢途径、细胞信号通路转导有关。该研究结果为进一步探讨σC蛋白的生物学功能奠定了基础,也为揭示σC蛋白与宿主因子相互作用进而调控DRV复制等机制研究提供线索。 相似文献
7.
《蚕业科学》2020,(2)
基于BmNPV感染前后宿主细胞BmN的蛋白质差异组学研究结果,发现宿主细胞中的BmAda3(B.mori alteration/deficiency in activation 3)蛋白在BmNPV感染前后,其表达水平发生了显著变化。为探究BmAda3蛋白在病毒侵染过程中的作用,构建原核表达载体pET28a-ada3,通过诱导表达、纯化获得目的蛋白并制备多克隆抗体。将构建的瞬时表达载体pIEx-1-gfp-ada3转染BmN细胞,激光共聚焦显微镜观察发现BmAda3蛋白主要分布在细胞核中。将构建的瞬时表达载体pIEx-1-ada3转染BmN细胞,荧光定量PCR显示BmAda3蛋白的过表达可显著抑制病毒基因组复制。MTT细胞活力检测结果表明,BmAda3蛋白的过表达具有显著增强细胞活力的作用,DNA片段化和流式细胞术检测结果也进一步证实BmAda3蛋白的过表达可在一定程度上抑制BmNPV感染诱导的宿主细胞凋亡。研究结果将为深入了解家蚕细胞与BmNPV的互作调控关系提供一些新的线索。 相似文献
8.
伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(Nedd4)存在相互作用。进一步,利用激光共聚焦试验确定过表达pUL56与Nedd4在转染HEK293T细胞的高尔基体存在共定位。通过互作,pUL56可以将细胞质分布的Nedd4重新定位于高尔基体。前期研究表明,含有WW结构域的宿主蛋白可以与含有PPxY(PY)基序的病毒蛋白互作。因此,本研究构建了pUL56PY基序丙氨酸突变体(PPxY/AAxY),利用Co-IP试验对pUL56突变体和Nedd4相互作用进行验证,结果表明随着pUL56PY基序突变的增加,蛋白互作能力逐渐减弱。此外,pUL56通过其PY基序显著下调Nedd4的表达。这些结果证实了PRVpUL56与Nedd4主要通过WW结构域/PY基序模式发挥相互作用,并下调Nedd4的表达。因此,本研究为阐明PRVpUL56与宿主相互作用的分子机制提供了参考依据。 相似文献
9.
10.
为探究在猪圆环病毒2型(PCV2)入核复制过程中发挥生物学功能的宿主核相关蛋白,本研究借助免疫沉淀技术联合蛋白质谱鉴定技术,从宿主细胞核膜提取物中筛选到了可与PCV2 Cap蛋白发生潜在互作的2个蛋白质：高迁移率族蛋白1(HMGB1)和精氨酸酶1(ARG1)。通过进一步的免疫共沉淀试验及激光共聚焦试验,证明了HMGB1、ARG1与PCV2 Cap蛋白的相互作用,且互作与Cap蛋白的核定位信号(NLS)无关。该研究为进一步探索PCV2入核复制的机制解析提供了重要信息。 相似文献
11.
【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。 相似文献
12.
This study was aimed to obtain polyclonal antibody against swine pseudorabies virus (PRV) Min A strain,and provide a theoretical basis for the study of the treatment and detection of PRV.This study was performed on PK-15 cell and proliferation of PRV was measured as TCID50 10-7.372,the protein concentration of PRV was measured as 3.6 mg/mL.Choosing five healthy male rabbits (2.5 kg±0.2 kg) as experimental animals and using PRV obtained as the antigen,we got polyclonal antibody against PRV.Antiserum titer was 1:32 000,antigen coating dilution was 1:40,the best coating conditions was 4 ℃ 12 h,the best blocking time was 1 h,the best working dilution of enzyme labled antibody was 1:8 000,the result of cell lesions neutralization test showed that PRV antiserum prepared in this assay at 1:16 dilution could protect 50% of PK-15 cells from being infected by PRV,and negative serum couldn't protect PK-15 cells from being infected by PRV.The study successfully prepared polyclonal antibodies against PRV. 相似文献
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本研究旨在获得抗猪伪狂犬病病毒(PRV)闽A株的多克隆抗体,为PRV的治疗与检测提供理论基础.本研究在PK-15细胞上进行PRV的增殖,测定其TCID50为10-7.372,粗提蛋白后,测定PRV蛋白浓度为3.6 mg/mL.试验选用25只健康、雄性、体重为2.5 kg±0.2 kg的新西兰大白兔为试验动物,用获得的PRV为抗原免疫后,获得抗PRV多克隆抗体.测定其抗血清效价为1:32 000,抗原包被稀释度为1:40,最佳包被条件为4 ℃ 12 h,最佳封闭时间为1 h,酶标二抗最佳工作稀释度为1:8 000.细胞病变中和试验结果表明,本研究制备的PRV抗血清在1:16的稀释情况下能保护50%的PK-15细胞免受PRV的攻击,而阴性血清不能保护PK-15细胞免受PRV的感染.结果表明本研究成功制备了PRV多克隆抗体. 相似文献
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本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。 相似文献
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旨在筛选PK-15细胞中与猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）复制起始区（origin of replication,Ori）互作的细胞蛋白谱,并初步探究PARP1蛋白对PCV2复制的调控。利用DNA-protein pull down结合LC-MS/MS方法筛选PCV2复制起始区DNA互作蛋白;对互作蛋白进行GO分析以及KEGG通路富集分析,并绘制蛋白互作网络图。在对互作蛋白进行分析的基础上,选择聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）蛋白,开展了深入研究。构建了PARP1蛋白以及PCV2复制蛋白Rep真核表达质粒,并利用DNA-protein pull down及DNA IP试验验证PARP1蛋白与PCV2 Ori的互作;通过Co-IP试验,研究了PARP1蛋白与PCV2 Rep蛋白的互作;在细胞中过表达或沉默PARP1蛋白,通过qPCR方法检测对PCV2复制的影响。本研究共鉴定到130种可能与Ori互作的宿主蛋白,其中,与DNA功能相关的蛋白共有45种,主要涉及宿主DNA损伤修复及DNA复制功能;验证了PARP1蛋白与PCV2基因组Ori以及Rep蛋白互作。用siRNA沉默PARP1蛋白表达后,PCV2基因组复制效率显著下降,瞬时过表达PARP1蛋白,PCV2基因组复制效率显著提高。综上所述,本研究筛选到130种可能与PCV2 Ori互作的细胞蛋白,发现PARP1蛋白可结合PCV2基因组Ori及Rep蛋白并促进PCV2的复制,为PCV2药物靶点选择及PCV2复制起始过程研究奠定了基础。 相似文献
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凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。 相似文献
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本研究以伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)Ra株体外感染不同的细胞系为模型,研究PRV Ra株最适细胞系。试验采用ST细胞、PK-15细胞、Vero细胞、F81细胞、DF1细胞、MDCK细胞和CEF细胞7种细胞作为该毒株的接种对象,观察毒株在这几种细胞上病变特点、细胞病变时间及病毒增殖规律等并进行比较。观察结果发现,受试的各种细胞在PRV感染期间均能表现明显的细胞病变,但不同细胞在病变时间上存在较大差异,其中PK-15和ST细胞在感染后24 h内出现明显细胞病变,时间最早。TCID50测定病毒增殖力结果表明,ST细胞在病毒增殖传代中毒力保持最好,与原毒株毒力相当,为106.9 TCID50/0.1 mL。本试验结果表明,ST细胞是较适合于PRV Ra株体外研究的细胞系。 相似文献
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Ding L Xu X Huang Y Li Z Zhang K Chen G Yu G Wang Z Li W Tong D 《Veterinary microbiology》2012,158(1-2):12-22
Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) has been reported to induce apoptosis in swine testis (ST) cells. However, the mechanisms underlying TGEV-induced apoptosis are still unclear. In this study we observed that TGEV infection induced apoptosis in porcine kidney (PK-15) cells in a time- and dose-dependent manner. TGEV infection up-regulated FasL, activated FasL-mediated apoptotic pathway, leading to activation of caspase-8 and cleavage of Bid. In addition, TGEV infection down-regulated Bcl-2, up-regulated Bax expression, promoted translocation of Bax to mitochondria, activated mitochondria-mediated apoptotic pathway, which in turn caused the release of cytochrome c and the activation of caspase-9. Both extrinsic and intrinsic pathways activated downstream effector caspase-3, followed by the cleavage of PARP, resulting in cell apoptosis. Moreover, TGEV infection did not induce significant DNA fragmentation in ammonium chloride (NH(4)Cl) pretreated PK-15 cells or cells infected with UV-inactivated TGEV. In turn, block of caspases activation also did not affect TGEV replication. Taken together, this study demonstrates that TGEV-induced apoptosis is dependent on viral replication in PK-15 cells and occurs through activation of FasL- and mitochondria-mediated apoptotic pathways. 相似文献
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旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子（CD81、TSG101）;PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30~200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显（P<0.01）,外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）;PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF3编码蛋白的体外表达 总被引：1，自引：0，他引：1
设计特异引物,以猪圆环病毒2型(PCV-2)杭州株HZ0201的基因组DNA为模板,PCR扩增出ORF3基因,构建了pGEX-4T-1-ORF3原核表达载体和pEGFP-C2-ORF3真核表达载体。ORF3基因全长315 bp,编码105个氨基酸。SDS-PAGE、Western blot分析及真核PK15细胞转染结果显示:ORF3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子量大小约为37.7 ku;ORF3重组蛋白在真核PK15细胞的细胞核和细胞浆都有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性。 相似文献