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为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。 相似文献
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禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。 相似文献
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以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒,并转化至表达宿主菌中;将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,对蛋白进行可溶性分析;利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示,在37℃下,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、0.25、0.5、0.25、0.75mmol/L的IPTG诱导4h时,表达量最高;2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,5种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blot分析显示,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2epGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应,为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。 相似文献
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为了确诊猪伪狂犬病病毒(PRV)的感染,探讨目前广西猪群中流行的PRVgE基因的变异特征,为更好地防控猪伪狂犬病(PR)提供参考依据,本研究采集了广西陆川某猪场保育猪群发生呼吸道症状的肺脏组织,并用Vero细胞进行病毒分离,应用PCR方法对分离株的gE基因进行克隆和测序,根据测序结果证实分离到1个PRV毒株,命名为GXLC1。分离株在Vero细胞上增殖,细胞出现典型的病变;GXLC1株gE基因与GenBank上20株国内外具有代表性参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.4%,氨基酸同源性为94.3%~99.6%;gE基因的遗传进化分析显示,GXLC1株与2012年的国内流行毒株亲缘关系较近,与欧美分离株亲缘关系较远;氨基酸序列分析显示,GXLC1株gE蛋白主要抗原表位区较之国内经典强毒株有3个氨基酸位点的变异,可能导致gE抗原性发生改变。本研究将分离到的1个PRV毒株进行了gE基因的分析,发现GXLC1株为近年来流行的变异株,gE蛋白在抗原表位区上有3个氨基酸位点的变异,这是否会影响GXLC1株毒力和抗原性的变化,还有待进一步研究;对gE基因变异特征的分析和病毒的分离为进一步丰富广西PRV的分子流行病学和疫苗的研制提供参考依据和重要材料。 相似文献
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贝类派琴虫和单孢子虫双重PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库中派琴虫和单孢子虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这2种原虫的双重PCR。对同一样品中的派琴虫和单孢子虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与试验设计相符的596bp(派琴虫)和244bp(单孢子虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,最低能检测到10pg的派琴虫和单孢子虫DNA。用该双重PCR对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,派琴虫的阳性率分别为14.6%,10.6%和15%,而未检出单孢子虫,结果提示派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可以用于贝类派琴虫和单孢子虫的临床快速检测。 相似文献
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利用氧化石墨烯(GO)负载H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体(PAb-H5N1)及牛血清白蛋白(BSA)作为信号放大材料,构建一种新型电化学免疫传感器用于检测H5N1亚型禽流感病毒。结果表明:以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器的灵敏度比不用此纳米复合物作为信号放大的高256倍。以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器对H5N1亚型禽流感病毒的检测限为2-15 HA unit·50μL-1,检测线性范围为2-15～2-8 HA unit·50μL-1。此传感器特异性好,灵敏度高,在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。 相似文献
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为调查广西某规模化鸡场健康鸡群Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)的感染情况,于2017年11月-2018年12月采集不同日龄鸡群咽喉拭子和泄殖腔拭子样品4700份,对样品进行FAdV-Ⅰ检测和hexon蛋白loop 1基因扩增,应用LaserGene7.1和MEGA4.1软件对loop1基因序列进行核苷酸和遗传进化分析。结果显示,FAdV-Ⅰ的阳性检出率为8.72%;40~70日龄和71~99日龄鸡群阳性FAdV-Ⅰ的检出率分别为28.17%和22.91%;测序获得的38条loop 1基因序列分析表明该鸡场健康鸡群感染了5个不同种的FAdV-Ⅰ,其中26.32%的序列为A种(FAdV-A)、2.63%为B种(FAdV-B)、10.53%为C种(FAdV-C)、39.47%为D种(FAdV-D)和21.05%为E种(FAdV-E);遗传进化分析表明该鸡场健康鸡群主要感染的种为FAdV-D,血清2型(FAdV-2)为优势血清型,其次为A种的血清1型(FAdV-1)和E种的血清8a型(FAdV-8a)和8b型(FAdV-8b)。结果表明,40~70日龄健康鸡群的FAdV-Ⅰ的检出率最高,在健康鸡群中感染的FAdV-Ⅰ主要为FAdV-D种中的FAdV-2。 相似文献
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通过比较10株鸭瘟强毒与11株鸭瘟弱毒的UL2基因序列(包括GenBank中所有登录的鸭瘟病毒UL2基因序列),发现鸭瘟弱毒的UL2基因均缺失了528bp的B片段。基于UL2基因B片段序列设计引物,建立了理论上能特异检测鸭瘟强毒的荧光定量PCR和常规PCR检测方法(即对鸭瘟强毒的检测为阳性,对鸭瘟弱毒的检测为阴性),并对PCR产物进行了克隆和测序分析。结果显示,2种检测方法除了对鸭瘟强毒的检测为阳性外,对5株鸭瘟弱毒的检测也均为阳性,PCR产物的测序分析也说明扩增产物为UL2基因的B片段。结果表明,不能通过在UL2基因的B片段设计引物,来建立特异检测鸭瘟强毒的检测方法。 相似文献