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根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献
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从3日龄健康小鸡肠道中分离到1株乳杆菌,用PCR方法从分离菌株扩增16S rRNA基因,获得大小为1340 bp的DNA片段,该片段的核酸序列已提交GenBank,登录号为EU290749。将分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与GenBank上其它乳杆菌进行同源性分析并建立进化树。结果表明,分离株的16S rRNA基因核苷酸序列与NCBI公布的鼠约氏乳杆菌分离株(AB295648)的同源性为99.6%,因此该分离菌株被鉴定为鸡约氏乳杆菌(chicken Lactobacillus johnsonii),命名为HN/0711。 相似文献
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为研究猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ的生物学功能,本研究应用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞总RNA中克隆出猪FcγR Ⅲ的cDNA序列,并对其进行了分析。结果表明,克隆到的序列长820 bp,包含有1个771 bp完整开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的猪FcγR Ⅲ序列(AF237453)的核苷酸同源性为99.9%;与人、牛、马、绵羊、猕猴、狗、猫、小鼠氨基酸同源性分别为61.6%、62.9%、55.3%、62.2%、63.0%、59.0%、61.8%和53.2%;蛋白质分子结构预测结果表明,该分子由信号肽(20个氨基酸)、胞外区(185个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(28个氨基酸)组成,在胞外区存在2个Ig样结构域。猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ基因的成功克隆,为进一步研究其结构与功能奠定基础。 相似文献
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为了研究Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)抗体依赖性增强作用(ADE)感染中的作用,对2种结构域蛋白进行表达、纯化,并免疫大白兔制备其特异性多克隆抗体IgG。应用制备的抗Sn-N-V-set IgG、CD163-SRCR5 IgG和正常兔IgG分别封闭PAMs细胞,然后使用猪抗PRRSV IgG与PRRSV悬液混合后制成的感染性免疫复合物感染已封闭的PAMs细胞。感染后每隔12 h收集细胞上清液1次,用已建立的实时荧光定量RT-PCR方法测定PRRSV的RNA拷贝数,同时以Marc-145细胞测定PRRSV的病毒滴度。结果显示,当Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域被其特异性抗体封闭后,能够显著抑制体外PRRSV感染PAMs细胞的抗体依赖性增强作用(ADE)(P<0.01)。结果表明,2种受体结构域均参与PRRSV-ADE感染。 相似文献
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[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础. 相似文献
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本试验旨在克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体。试验中应用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-Sn150,成功表达了分子质量大小约为43.1 ku的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白pET-Sn150免疫小鼠,制备获得鼠抗pET-Sn150重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接 ELISA 和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-Sn150多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。本试验克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因并成功表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。 相似文献
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根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCC VR-2332)的部分ORF7保守序列、猪流感(SIV)A/Swine/HeNan/703/2001(H3N2)株的NP基因保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为300和457 bp的特异性基因片段,通过优化RT PCR条件,最终建立了可同时检测PRRSV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,该方法能检出约10 pg总RNA病毒。应用该方法分别对河南省不同地区送检的26头份病死猪的鼻腔分泌物、气管、血液、肺组织等进行检测,结果9头份PRRSV阳性,4头份SIV阳性,其中4头份SIV和PRRSV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRRSV和SIV复合RT-PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,为在分子水平上对PRRSV、SIV的混合感染进行早期快速诊断提供了科学依据。 相似文献