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为建立敏感、特异的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,将ASFV K205R基因与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,用相变循环纯化ELP-K205R融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,用相变循环回收K205R蛋白,用抗体阳性血清对重组K205R蛋白进行ELISA鉴定。结果表明:重组大肠埃希菌能正确表达ELP-K205R融合蛋白,相变循环纯化的融合蛋白纯度大于80%; TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,回收的重组K205R蛋白纯度大于95%,能被特异抗体阳性血清识别;重组K205R抗原与抗体阴性猪血清反应阴性,与抗体阳性猪血清反应阳性,D_(450 nm)值与血清稀释倍数具有线性相关性。用重组K205R抗原对已知猪血清进行ELISA检测,结果显示24份ASFV抗体阳性血清为检测阳性, 24份ASFV抗体阴性血清为检测阴性,检测符合率为100%。这一研究提示制备的无标签重组K205R抗原可用于ASFV抗体检测。 相似文献
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为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1∶4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54ng/mL,持续时间为15d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。 相似文献
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用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。 相似文献
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大肠杆菌F18ac菌毛FedA蛋白的表达与鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
根据已经发表的F18ac菌毛A亚单位的基因序列(FedA)设计一对引物,利用PCR技术从重组质粒T 8813A 中扩增到一段序列,并按预定的阅读框插入表达性质粒载体pGEX 6p 1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedA/ac,并转化大肠杆菌BL 21 获得重组菌PPFedA/ac。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该序列大小为456 bp,与已发表的FedA/ac结构编码序列完全一致。通过对菌体裂解物的SDS PAGE 分析以及Western blotting 鉴定,证明重组大肠杆菌PP FedA/ac的可以表达融合蛋白形式的FedA/ac (命名为GST FedA/ac),即FedA/ac蛋白(15.317 ku)与谷胱苷肽转移酶(27.335 ku)相连组成分子量为42.652 ku的融合蛋白。利用GST FedA/ac制备的兔抗GST FedA/ac 血清与大肠杆菌F107/86 株( F18ab )、2 134 P 株(F18ac )进行的玻板凝集试验呈现阳性反应,进一步表明了表达的正确性。 相似文献
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重组溶菌酶质粒pcDNAKLYZ治疗泌乳期奶牛乳房炎 总被引：1，自引：0，他引：1
通过比较注射人溶菌酶重组质粒pcDNAKLYZ的隐性乳房炎奶牛注射前后的奶样中细菌计数结果,对重组溶菌酶基因工程质粒治疗奶牛乳房炎的效果进行分析。对乳房炎患牛的156个乳区治疗前后312份奶样进行细菌培养,其中在注射前的乳样的培养结果中,阴性率为0（0/156）,菌落数在50以内的比率为12.82%（20/156）,在51～100的比率为16.67%（26/156）,大于等于100的比率为70.51%（110/150）;在注射人溶菌酶的重组质粒pcDNAKLYZ后的奶牛乳样的培养结果中,阴性率为51.92%（81/156）,菌落数在50以内的比率为45.51%（71/156）,菌落数在51～100的比率为0%（0/156）,大于等于100的比率为2.56%（4/156）。因此,从细菌计数结果来看,重组质粒组的阴性及小于50的比率（97.44%）远高于治疗前（12.82%）,重组质粒的抑菌效果显著（P〈0.05）,该重组质粒对奶牛乳房炎具有较好的治疗效果。 相似文献
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试验选用56周龄新扬州鸡产蛋鸡150只,随机分为3个处理,每个处理5个重复,各重复10只.研究经腿肌注射0、200和400μg鸡甲状旁腺素基因质粒(pCEP4-PTH)对蛋鸡生产性能、蛋壳质量和血液部分激素的影响.试验结果表明,pCEP4-PTH基因质粒可改善蛋鸡生产性能;200μg注射量可显著改善蛋壳强度(P<0.05),400μg注射量对蛋壳质量影响不显著;pCEP4-PTH基因质粒可在蛋鸡体内良好表达,甲状旁腺素(PTH)水平均显著升高(P<0.05),且注射400 μg时达到极显著水平(P<0.01),注射400 μg pCEP4-PTH基因质粒具有促进内源降钙素(CT)和雌激素(E2)分泌的作用(P<0.05),因而不利于其生物学效应的发挥,两试验组骨钙素(BGP)与对照组差异不显著,提示生产性能和蛋壳质量的改善未对骨骼造成不良影响.pCEP4-PTH基因质粒可改善蛋鸡生产性能和蛋壳质量,且不影响骨骼质量. 相似文献
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根据Wood 46株金黄色葡萄球菌a溶血素(a-HL)基因序列设计了引物，用高保真PCR从1800株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了0．9kb的a-HL基因，序列测定结果显示，两菌株a-HL基因的核苷酸序列有6个碱基差异，但仅引起1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏茵外膜蛋白A信号肽序列与a-HL编码区融合，并将其第130～134位氨基酸替换为5个连续的组氨酸，获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入pET-30a质粒，用获得的重组质粒pET-H5转化感受态大肠埃希氏菌，获得分泌性表达H5的重组茵。经IPTG诱导后，重组菌表达出分子质量为35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为180ng／mL，能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性，且能被Zn^2 抑制。提示，表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白，能用作真核细胞内玻璃态保存的渗透剂。 相似文献
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动物用质粒DNA内毒素去除方法的建立及其质量检验 总被引：5，自引：0，他引：5
用自行改进设计的TritonX-114方法去除动物用重组质粒DNA中的内毒素,鲎试剂检测方法确定每毫克质粒DNA中内毒素的含量为50 EU.将3种不同方法制备的重组质粒pEGFPNl包裹后转染COS-7、MDCK和Marc145细胞,结果表明,经TritonX-114去除内毒素后的质粒DNA(A)与无热源质粒提取试剂盒制备的质粒DNA(B)的转染效率相当,比未经内毒素去除的质粒DNA(C)的转染效率高.将上述3种方法制备的pcDNAlacZ经PEI包裹后尾静脉注射小鼠.注射后每隔2 d扑杀小鼠,取其心、肝、脾、肺和肾组织,定量检测β-半乳糖苷酶的表达和持续时间,结果显示报告基因仅在小鼠的心、脾和肝组织中表达至第8天,A与B的表达水平接近,且明显高于C制备的pcDNALacZ的表达水平,提示经TritonX-114去除内毒素后的质枉DNA可提高转染效率和表达水平.多种动物体内注射重组质粒后,无体温升高等异常-临床表征,进一步说明了使用经TritonX-114去除内毒素的质粒DNA具备良好的安全性. 相似文献