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为了解广西地区血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的基因特征,本研究对实验室前期分离的一株FAdV-4（命名为GX2019-010）进行了全基因组测序,对所获核苷酸序列进行同源性比对和遗传进化分析,并进一步分析了主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列。结果显示,GX2019-010全长43 719 bp,GC含量为54.9%,主要包括43个潜在蛋白质编码区域。核苷酸序列同源性比对发现,GX2019-010与致病株MX-SHP95的同源性为95.8%,与非致病株ON1和KR5同源性分别为95.0%和95.2%。遗传进化分析显示,GX2019-010与中国FAdV-4近几年的流行毒株在同一分支,而与国外FAdV-4毒株不在同一分支,说明FAdV-4存在遗传差异,主要的差异存在于基因组的右端,国内分离株均出现1 966 bp的缺失,其中包括ORF19、ORF48和ORF27基因的缺失,说明中国流行的FAdV-4具有地域性。对主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列分析发现,3个主要结构蛋白均有氨基酸位点的突变,其中Fiber-2的突变位点最多。本研究丰富了广西地区FAdV-4的基因库,为今后心包积液-肝炎综合征（HHS）的防控及流行病学调查研究提供了参考依据。 相似文献
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为跟踪调查广西活禽市场新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的流行分布和分子演化特征,2018年在广西不同城市10个活禽市场随机采集鸡、鸭、鹅和鸽子泄殖腔和咽喉拭子样品2820份,通过病毒分离与F基因扩增和测序,分析其遗传进化特征。结果显示:从4种宿主中共分离得到54份NDV,包含CLASSⅠ基因1b亚型、CLASSⅡ基因Ⅰ型和CLASSⅡ基因Ⅻ型三种基因型,且发现同一宿主存在不同基因型混合感染的情况。CLASSⅠ基因1b亚型NDV占比最大(50/54,92.5%)。遗传进化分析显示,广西分离株与同基因型参考株处于不同的小分支,存在地域差异。 相似文献
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为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。 相似文献
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为了分析禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)后,对其细胞因子IL-17、IL-18和IFN-γmRNA转录水平的影响,探讨禽呼肠孤病毒感染机制和宿主之间的作用关系。本试验将ARV-S1133感染CEF细胞后,运用荧光定量PCR技术,测定和分析ARV结构蛋白σC和CEF细胞的IL-17、IL-18及IFN-γ的mRNA动态转录水平。结果表明,ARV-S1133感染CEF细胞10h后病毒结构蛋白σC mRNA的相对表达量开始迅速上升,在48h达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF细胞中的IL-17、IL-18和IFN-γmRNA表达量发生变化,IL-17和IFN-γmRNA转录水平在感染早期迅速上调,感染后6h达到第一个峰值,分别上调8.77倍和11.17倍,随后下降,在感染36、48、60h后大幅度上升,且在48h达到峰值,表达量分别为97.19倍和111.58倍。IL-18mRNA转录水平在整个感染过程中表达量较低,在感染6h后微量上调(1.39倍),在感染中后期,其表达量呈下调趋势,感染48h时,IL-18mRNA表达量最低,与对照组相比下调0.19倍;5个不同滴度的ARV病毒感染CEF细胞24h后,3个细胞因子mRNA的表达量与病毒滴度线性相关,IL-17和IFN-γmRNA转录水平与病毒滴度正相关,IL-18mRNA转录水平与病毒滴度负相关。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-17、IL-18、IFN-γ的mRNA转录水平上调,说明IL-17、IL-18、IFN-γ可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。 相似文献
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为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。 相似文献
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参照GenBank中禽源核苷二磷酸激酶2(NME2)基因序列,设计了NME2基因的特异性引物。采用RT-PCR扩增NME2基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-NME2。将构建好的重组质粒pEF1α-Myc-NME2转染DF1细胞后,采用间接免疫荧光和Western blot技术对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-NME2融合蛋白在DF1细胞内得到了正确表达。本研究为后续研究禽源NME2基因的功能奠定了基础。 相似文献
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本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠhexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1020bp。重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1ku,与预测值相符。经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。 相似文献
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针对当前对虾(Penacus orientalis)养殖业亟需研究开发一种简便快速、敏感特异的检测技术来实现对对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)进行检测监控的现状,本研究根据WSSV基因组ORF120保守区序列,设计合成6条环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)特异性引物,分别为外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LF/LB。利用钙黄绿素/氯化锰作为检测指示剂,通过对反应条件优化,建立了可视化WSSV-LAMP检测方法。在检测中未发生扩增反应时,钙黄绿素被氯化锰螯合,呈淬灭状态。当样品中有WSSV靶基因存在时,大量DNA被合成,并产生同样大量的焦磷酸根离子,此时焦磷酸根离子竞争性与Mn2+结合,形成稳定的不溶性焦磷酸盐沉淀,钙黄绿素被释放而发出肉眼可见的黄绿色荧光。该扩增一次性反应约60min即可完成对待检样品的检测。经测定,本方法能特异性地检测出阳性样品中的WSSV目的基因,并能通过扩增产物所产生的黄绿色变化与阴性样品区别;本技术对目的基因的最低检测量为1fg。在临床检测试验中,WSSV-LAMP与世界动物卫生组织(OIE)推荐的WSSV-PCR检测方法均能从250份对虾样品中,同时检测到15份编号相同的阳性样品,符合率达100%。除此之外,WSSV-LAMP还能从另外3份PCR检测为阴性的样品中检测到目的基因。比较这两种方法的阳性检出率,WSSV-LAMP为7.2%(18/250),WSSV-PCR为6.0%(15/250),WSSV-LAMP对自然感染的临床样品阳性检出率要比WSSV-PCR高。说明WSSV-LAMP在病毒含量较低的临床样品检测中比OIE推荐的PCR方法具有更高的技术优势,能在对虾养殖生产上的临床诊断、育种及口岸检疫,甚至海洋生态监测中对WSSV进行现场检疫。 相似文献
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33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ）的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。 相似文献