布鲁菌铁转录调控因子rirA基因突变株的构建与鉴定     

王震  王勇  张倩  陈创夫  郭飞  李天森  张辉  王远志  刘志强 《动物医学进展》2017,38(10)

为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。  相似文献   

牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用     

任艳  陈创夫  乔军  王鹏雁  盛金良  王远志  张沾  李臻 《畜牧兽医杂志》2010,29(5):4-7

以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因5'-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%(18/25),与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。  相似文献   

PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因克隆与真核表达     

白晶  剡根强  丁壮  陈创夫  李志杰  丛彦龙  母连志 《中国兽医学报》2010,30(5)

根据PRRSV VR-2332毒株核苷酸序列,设计针对GP5基因的特异引物,以PRRSVJL/07/SW毒株细胞培养物为模板,利用RT-PCR方法,成功的扩增出GP5基因,将该基因与真核表达载体pCI-neo连接,转染Marc-145细胞中,用间接免疫荧光试验、SDS-PAGE和western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果:RT-PCR分别扩增出GP5基因大小与预期一致,与国际PRRSV美洲型VR-2332毒株的GP5基因序列同源率为89.2%;间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blot试验证明GP5蛋白在Marc-145细胞中成功表达;同时利用pCI-neo真核表达载体在Marc-145细胞中成功表达了PRRSVJL/07/SW毒株GP5基因,为下一步研究蛋白的功能奠定了基础。  相似文献   

金黄色葡萄球菌ClfA基因表达产物在小鼠的免疫原性分析     

杨明锋  陈创夫  曹旭东  刘君  王正荣  李贞  乔军 《畜牧兽医学报》2010,41(12)

为分析原核表达的金黄色葡萄球菌ClfA部分基因表达产物的免疫原性,作者采用PCR方法从奶牛乳房炎病例中分离的金黄色葡萄球菌中克隆出ClfA基因的部分片段,测序后用DNAman软件进行抗原位点分析。构建原核表达质粒ClfA-pET-28a+,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达。用His-bind柱纯化表达蛋白,加弗氏佐剂混匀后免疫小鼠。小鼠分娩后乳腺内攻菌,检查乳腺组织病理变化,乳腺组织中金葡菌数量和TNF-α水平来评价原核表达蛋白的免疫保护效果。结果显示转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导可以表达ClfA蛋白。原核表达蛋白抗原免疫小鼠可以显著降低乳腺组织内金葡菌数量,TNF-α水平也显著低于对照组和全菌蛋白抗原组,提示原核表达的ClfA蛋白免疫小鼠可以减少乳腺内金葡菌定植的数量,减轻乳腺内感染造成炎症的严重程度。本研究表明原核表达金黄色葡萄球菌ClfA蛋白有一定的免疫保护效果,为奶牛乳房炎疫苗的研究提供科学依据。  相似文献   

新疆北部地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及其血细胞成分分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

张银亮  陈创夫  乔军  刘贤侠  王利晓  余胜利  胡朝辉 《中国草食动物》2010,30(4):52-55

对临床确诊为奶牛子宫内膜炎的75头荷斯坦奶牛进行子宫炎性分泌物采样,用常规方法进行细菌分离培养及鉴定,并对19头患子宫内膜炎奶牛和8头健康奶牛进行血细胞成分分析。结果共分离鉴定出细菌189株,其中金黄色葡萄球菌56株（29．62％）,大肠埃希氏菌52株（27．51％）,铜绿假单胞菌25株（13．23％）,蜡样芽孢杆菌22株（11．64％）,无乳链球菌17株（8．99％）,停乳链球菌10株（5．30％）,沙门氏菌3株（1．59％）,中间葡萄球菌2株（1．06％）,表皮葡萄球菌、普通变形杆菌各1株（0．53％）。血细胞成分分析结果表明,子宫内膜炎奶牛组与健康奶牛组相比,淋巴细胞（LYM）、粒细胞（GRAN）、平均血红蛋白含量（MCH）、血小板分布宽度（PDW）、血小板压积（PCT）等差异极显著（P〈0．01）,其余指标差异不显著（P〉0．05）。  相似文献   

转基因植物生产疫苗的研究现状及前景     

包慧芳  陈创夫  陈福双  任雪艳  王彦芹 《猪业科学》2004,21(11):61-63

对转基因植物作为生物反应器生产可食疫苗的作用机理、优点、可行性及研究现状进行概述,指出了转基因植物疫苗研究面临的问题与前景。  相似文献   

无乳链球菌SIP基因的克隆和原核表达     

褚明亮  陈创夫  刘君  乔军  曹旭东 《塔里木大学学报》2008,20(3)

目的重组表达无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic protein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白.方法用PCR的方法从石河子分离株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入PBST载体,并构建原核表达载体pET-32a( )-SIP.用BL21(DE3)/pET系统表达Trix-SIP融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物.结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中无乳链球菌(DQ650634)的SIP的基因序列同源性为98.62%.SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET-32a( )-SIP总蛋白中出现一条相对分子质量为71KDa的新蛋白带.West-ern blot分析显示,SIP蛋白可与无乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应.结论已成功表达SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础.  相似文献   

牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响   总被引：1，自引：1，他引：0  

杨琴  邓肖玉  谢珊珊  易继海  王勇  张倩  王震  陈创夫 《畜牧兽医学报》2022,53(4):1192-1200

旨在研究牛种布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统(T4SS)对巨噬细胞内质网应激和细胞凋亡的影响,深入探究布鲁氏菌的分子致病机制.本研究以牛种布鲁氏菌疫苗株A19及其T4SS启动子缺失株A19ΔVirB侵染小鼠巨噬细胞,分别在侵染的6、12、24 h收集细胞RNA和总蛋白,通过qRT-PCR以及Western blot检测内质网应激标...  相似文献   

二狼山白山羊遗传性甲状腺肿发病机理及诊断研究——Ⅰ.测交试验及甲状腺组织中T_3、T_4的免疫组化定位定量研究     

刘永庆  陈创夫  张远钰  王水琴 《中国兽医学报》1991,(2)

内蒙古二狼山白山羊遗传性甲状腺肿杂合子的测交试验,以及其纯合子甲状腺组织中T_3、T_4免疫组化定量、半定量和定位分析结果表明,本病属常染色体单基因隐性遗传病;其纯合子羔羊甲状腺明显肿大(P<0.01),甲状腺组织高度增生,T_3、T_4含量明显降低(P<0.01);T_3、T_4主要定位于滤泡腔胶质和滤泡上皮细胞滤泡腔缘的胞浆中,且着色强弱不一.T_3、T_4的半定量与定量分析之间呈密切的直线相关关系.讨论了二狼山白山羊甲状腺肿大的原因、结果,以及T_3、T_4的定位与甲状腺上皮细胞功能的关系.  相似文献   

传染性法氏囊病病毒VP2基因真核细胞表达载体的构建及免疫应用研究   总被引：1，自引：0，他引：1  

陈创夫  乔军等 《动物科学与动物医学》2001,18(6):29-32

应用DNA重组技术将含有IBDV保护性抗原VP2质粒，以EcoRI、xhoI酶切，将酶切得到的VP2基因移入到载体pcDNA3CMV启动子下游，得到含有IBDV VP2基因的真核表达载体pcD-VP2基因疫苗。pcDVP2体外转染细胞能正确表达目的的蛋白，免疫雏鸡后20d，在体内可检测到特异性抗体。  相似文献