汉坦病毒L基因的分段克隆及原核表达     

李茂中  刘家森  郭东春  姜骞  林欢  曲连东 《中国预防兽医学报》2012,34(2):143-145

为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物.通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达.SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白.Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应.  相似文献   

仙台病毒P基因的原核表达及抗原性分析     

蒋良丰  刘家森  司昌德  郭东春  姜骞  曲连东 《中国预防兽医学报》2009,31(3)

根据GenBank公布的仙台病毒(SeV)磷蛋白(P)基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增P基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a中;重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后.转化感受态细胞BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达,获得相对分子量为99.6 ku的融合蛋白.经western blot及ELISA分析表明表达的融合蛋白具有良好的抗原性.  相似文献   

产气荚膜梭菌α毒素研究进展   总被引：1，自引：0，他引：1  

刘家森  刘怀然  陈洪岩  李一经 《中国兽医杂志》2005,41(5):27-29

产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)α毒素是第一个被赋予酶活性的细菌毒素 ,194 1年Mac Farlane和 Knight将其命名为磷脂酶 C。产气荚膜梭菌是一类革兰氏阳性厌氧粗大杆菌 ,大小 3～4μm× 1～ 1.5μm,分布广泛 ,恶劣时可产生高抵抗力的内生性孢子。该菌产生的外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν 12种以及肠毒素 (也称为芽胞相关蛋白 ) ,但主要起作用的是α、β、ε、ι4种。根据细菌产生外毒素的种类差别 ,可将产气荚膜梭菌分成 A、B、C、D、E等 5型。各型菌均可产生α毒素 ,其中以 A型菌产生的最多。毒素…  相似文献   

禽多杀性巴氏杆菌PCR诊断方法的建立   总被引：3，自引：0，他引：3  

亓英芳  刘家森  张在平  刘思国  曲连东 《黑龙江畜牧兽医》2008,(7)

随着现代分子生物学和生物信息学的发展,PCR技术已经在病原检测方面得到了广泛的应用.试验旨在利用PCR技术建立一种禽巴氏杆菌病原的快速、特异性强的检测方法.  相似文献   

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立     

李慕瑶 姜骞刘家森  司昌德韩凌霞 曲连东 《中国兽医科技》2007,37(3):218-222

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。  相似文献   

小反刍兽疫病毒芯片式数字PCR检测方法的建立及应用     

杨鸣发  马云云  于志亚  刘家森  康洪涛  姜骞  曲连东 《中国动物检疫》2021,38(12):91-98

为建立一种准确、快速、敏感性更高的小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）检测方法,建立了一种芯片式数字PCR（cdPCR）检测方法。根据GenBank中公布的PPRV Nigeria75 /1疫苗株N基因序列设计1对引物,PCR扩增大小为166 bp片段,构建pMDTM18-N标准质粒并优化反应条件,建立了PPRV N基因cdPCR检测方法,并与实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果显示：当质粒标准品浓度在1.22×（105~102）copies/μL范围时,cdPCR检测方法比普通RT-PCR灵敏度高1 000倍,且稳定性好,特异性强;当标准品浓度在1.22×（105~10-3）copies/μL范围时,cdPCR与RT-qPCR相比具有相同的特异性,但灵敏性比RT-qPCR高100倍;与RT-qPCR 测定结果（13.29±6.74）copies/μL相比,cdPCR的最低检测限更低,约为（0.44±0.14）copies/μL;cdPCR对47份临床样本的PPRV核酸阳性检出率（25.5%）高于RT-qPCR（17.0%）。结果表明,建立的cdPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为预防PPR早期流行提供了一种快速有效的诊断和定量检测方法。  相似文献   

兔出血症病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的实验研究     

原冬伟  刘家森  郭东春  司昌德  姜骞  林欢  穆亚芳  刘行波  曲连东 《中国预防兽医学报》2011,33(8)

为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。  相似文献   

兔魏氏梭菌病     

刘家森 《畜牧兽医科技信息》2003,19(9):55-56

魏氏梭菌病,又称兔产气荚膜梭菌(A型)病,是兔的一种急性致死性腹泻病,其发病率、死亡率均高,对养兔业的危害极大,造成巨大的经济损失。1 病原:魏氏梭菌即产气荚膜梭菌,一般可分为A、B、C、D、E、F六型。兔的魏氏梭菌病主要由A型引起,少数为E型。A型魏氏梭菌为革兰氏阳性大杆菌,两端稍钝圆,无鞭  相似文献   

禽白血病劳斯肉瘤病毒衣壳蛋白P27基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备   总被引：6，自引：0，他引：6  

乔彩霞  关云涛  陈洪岩  刘怀然  蔡雪辉  李昌文  葛俊伟  刘家森 《中国预防兽医学报》2004,26(3):169-173

从人工感染禽白血病劳斯肉瘤病毒的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中提取RNA,通过RT-PCR方法扩增出720bp的gag P27基因片段,克隆至pMD18-T载体,酶切鉴定后进行序列测定和分析,表明该片段编码序列与国外RSV分离株(JO2342)的同源性达97.3%.将该片段亚克隆至pGEX-6 P-1原核表达载体,转化受体菌BL-21,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明目的基因得到高效表达,所表达蛋白是大小为56kD的融合蛋白,占菌体总蛋白的23%.表达产物经Glutathion Spharose4 B树脂亲和层析法纯化后,每100 mL菌液最终可获得5 mg重组t27蛋白,蛋白纯度在90%以上.用兔抗自然P27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组P27蛋白有抗原反应活性.用纯化的重组P27蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应.所制备的重组P27蛋白和多克隆抗体将为禽白血病的诊断及ELISA试剂盒的研制奠定基础.  相似文献   

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立     

曲泽慧  陈佩佩  张爱芹  郭东春  林欢  姜骞  刘家森  师东方  曲连东 《中国畜牧兽医》2013,(7):65-68

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314 bp;最终确定dNTP终浓度0.4 mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25 μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。  相似文献