禽多杀性巴氏杆菌PCR诊断方法的建立   总被引：3，自引：0，他引：3  

亓英芳  刘家森  张在平  刘思国  曲连东 《黑龙江畜牧兽医》2008,(7)

随着现代分子生物学和生物信息学的发展,PCR技术已经在病原检测方面得到了广泛的应用.试验旨在利用PCR技术建立一种禽巴氏杆菌病原的快速、特异性强的检测方法.  相似文献   

基因免疫制备牛分枝杆菌MPB64抗原单克隆抗体     

刘建东  刘思国  王春来  宫强  王勇  迟磊  赵昆 《中国预防兽医学报》2007,29(11):870-873

为了建立针对牛分枝杆菌分泌抗原MPB64的检测手段,制备该抗原的单克隆抗体,构建真核表达载体pcDNA-mpb64,以原核表达并纯化的融合蛋白H-MPB64包被ELISA板,建立单克隆抗体检测方法。利用基因免疫方法免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出针对牛分枝杆菌分泌蛋白MPB64的单克隆抗体一株,并制备了腹水,经鉴定腹水效价达到1∶10240,采用硫酸铵沉淀法纯化腹水,纯化抗体效价为1∶8000,为今后研制分枝杆菌鉴定技术奠定基础。  相似文献   

胸膜肺炎放线杆菌菌毛研究进展     

郭洋  刘思国  王春来  张秀华  邵美丽  郭设平  宫强 《现代畜牧兽医》2006,(6):61-64

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleurop—neumoniae，APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的致病菌，能够引起各个年龄阶段的猪发生急性或慢性感染。  相似文献   

牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83和ESAT-的融合表达及重组蛋白的初步应用     

郭设平刘思国  张秀华王春来 宫强郭洋  邵美丽 《畜牧兽医学报》2006,37(7):676-680

应用PCR方法从牛分枝杆菌Vallee株基因组中扩增获得mpb70、mpb83和esat-6三个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术（splicing by overlap extension，SOE）获得融合基因mpb70-mpb83后，将mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a（＋）中得到重组质粒pET70-83-E6。转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态后，经IPTG诱导以可溶的形式表达融合蛋白。用Ni^2＋亲合层析的方法纯化该融合蛋白。Western blot分析显示：该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应，而与牛副结核病阳性血清不反应。用该纯化蛋白初步建立了间接ELISA方法，并检测了117份临床血清样本（其中67份为PPD阳性牛血清），阳性率为39．32％（46／117）份，与PPD皮试诊断的符合率为82．05％（96／117）。  相似文献   

胸膜肺炎放线杆菌Apxll毒素的基因序列特征     

王春来  刘思国  邵美丽  宫强  郭设平  王勇 《中国预防兽医学报》2006,(6)

为了深入地了解胸膜肺炎放线杆菌(APP)分泌的ApxⅡ毒素的分子结构及序列特征,本实验以一株APP 7型现地分离株L25-4株为实验材料,对其分泌的ApXⅡ毒素的结构基因apxⅡA及其上游启动子区进行了PCR扩增和测序。结果表明APP7型L25-4株apxⅡA基因与其它血清型apxⅡA基因核苷酸序列同源性达99．5%以上,氨基酸序列同源性达98．5%以上。在ApxⅡA蛋白的N末端有3个大的疏水结构域,分布在240～422位氨基酸之间。在ApxⅡA蛋白的C末端有富含甘氨酸(Gly)和天门冬氨酸(Asp)的九肽(nonapeptides)重复序列Leu/Ile/Phe-Xaa-Gly-Gly-Xaa-Gly-Asm/Ssp-Asp-Xaa,串连重复9次。这些结构域的起始氨基酸的位置分别为374、503、630、735、753、762、771、780和802。推定的赖氨酸酰基化作用位点为557位氨基酸,与E．coli的HlyA相比,在688位氨基酸处少了一个赖氨酸酰基化作用位点。apxⅡA基因启动子-10区序列为AATAAT,-35区序列为TTAAT,-10区与-35区间隔序列为11个碱基。  相似文献   

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达   总被引：4，自引：3，他引：4  

邵美丽  刘思国  王春来  郭洋  张秀华  郭设平  佟恒敏 《中国预防兽医学报》2006,28(2):139-141

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株生物学特性及其免疫原S1基因的克隆与序列分析     

刘明春  江国托  刘思国  赵玉军  李雪梅 《中国预防兽医学报》2000,(Z1)

本研究对分离自沈阳地区的一株传染性支气管炎病毒（ＳＹ毒株）进行了生物学特性的研究,同时成功地对其免疫原Ｓ１基因进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆与序列分析。 通过电镜观察、动物回归试验、血凝特性研究等试验验证分离自沈阳地区的ＳＹ毒株确实为一株传染性支气管炎病毒。气管环组织培养交叉中和试验结果表明,分离株ＳＹ株不同于参考毒株澳大利亚Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１,且不同于国内其它流行株ＨＤ、ＨＢ、ＸＢ、ＤＢ等,是一个新的变异株。 利用ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＳＹ毒株的Ｓ１基因,得到预期的约１．７Ｋｂ片段;并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ位点,在大肠杆菌ＤＨ５ａ中实现目的基因的克隆。经限制性核酸内切酶分析及ＰＣＲ鉴定,证实为阳性重组质粒,利用末端双脱氧链终止法对其测序,得到Ｓ１基因全长１６４０ｂｐ,包括整个开放阅读框。通过序列分析软件ＤＮＡＳＩＳ、ＰＲＯＳＩＳ、ＭＥＧＡ等软件对Ｓ１基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明：分离株ＳＹ与７株参考株和国内流行株ＨＤ株相比,无论是核苷酸序列同源百分率还是氨基酸序列同源百分离都较低,均未达到８０％,这就提示我们ＳＹ毒  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株核蛋白基因的分子克隆     

刘思国  江国托  康丽娟  刘忠贵  卢景良  刘明春 《中国兽医学报》2000,20(3):216-218

为了给鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV)核蛋白基因的遗传变异以及主要功能区的定位研究奠定基础 ,应用特异性引物扩增了 1 0株 IBV中国分离株的核蛋白基因 ,PCR产物全长为 1 .5kb。用 Eco RV和 Kpn 限制性内切酶进行酶切修饰后 ,连接到经过同样处理的载体 p UC1 1 9上。经 PCR、酶切、斑点杂交及 Southernblotting杂交鉴定 ,证实获得了含有 IBV的核蛋白基因的重组质粒  相似文献   

结核分枝杆菌酯酶Rv1400c原核表达及表达产物的酶活性分析     

陶荣珊  李金伟  刘思国  王全凯 《吉林农业大学学报》2014,(6)

为探究结核分枝杆菌酯酶Rv1400c活性,以进一步研究Rv1400c的结构和功能。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,对Rv1400c基因进行扩增,并将其克隆到p ET28b(+)原核表达载体上,构建p ET28b-Rv1400c重组质粒,然后将构建的重组质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,增菌后用IPTG进行诱导表达再用亲和层吸树脂法进行纯化,利用不同底物、不同p H、不同温度对纯化后的Rv1400c酯酶进行活性分析。结果表明:成功构建出p ET28b-Rv1400c重组质粒;SDS-PAGE和Western blot显示,Rv1400c以包涵体形式表达,蛋白分子质量为39 ku;在对8种底物的筛选中发现Rv1400c在C2~C14中具有活性,其中以在C2中活性最好;在以C12为底物、p H 8.0、37℃条件下酯酶活性最高。  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株S1基因序列测定及同源性分析     

刘明春  江国托  康丽娟  刘思国  赵玉军 《中国预防兽医学报》2002,24(1):1-3

通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株（SY株）的免疫原S1基因cDNA，将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点中，测定插入片段核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。序列分析表明，SY毒株S1基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H120、N1-62、Gray、6/82、Ark99等毒株的同源百分率都低于80%。  相似文献