伪狂犬病毒变异株（JS-2012）对仔猪的致病性研究     

童武  郑浩  单同领  刘飞  梁超  李国新  姜一峰  于海  高飞  周艳君  童光志 《中国动物传染病学报》2014,(5):10-14

本实验室2012年从江苏省太仓市某发病猪场分离到1株变异的伪狂犬病毒,命名为JS-2012。为了研究该分离株对仔猪的致病性,将12头15日龄的伪狂犬病毒阴性仔猪随机分为3组,其中2组（每组5头猪）分别通过肌肉注射和滴鼻接种JS-2012毒,第3组2头猪做空白对照。接种病毒的仔猪在攻毒后24 h体温均开始升高,4 d后开始死亡,死亡率为100%。临床观察发现,滴鼻组仔猪发病死亡明显快于肌肉注射组。对病死猪进行剖解,均可见大脑血管扩张并出血等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片显示猪的脑蛛网膜下腔严重出血,其他各脏器也均有严重病理变化。结果表明该变异株JS-2012为伪狂犬强毒毒株。  相似文献   

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞的差异转录基因文库构建     

肖燕  安同庆  田志军  韦天超  姜一峰  彭金美  周艳君  仇华吉  童光志 《中国预防兽医学报》2009,31(1)

为鉴定高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后,细胞内转录发生差异的基因,本研究采用抑制性消减杂交技术,以HP-PRRSV HuN4株感染后48 h的PAM细胞mRNA为实验方(Tester),以未感染的PAM细胞为驱动方(Driver)进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生上调的基因.反之,实验方与驱动方互换进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生下调的基因.将2种杂交所得的差异转录基因经PCR扩增后分别克隆到T载体中并转化大肠杆菌感受态细胞,从而构建了正向(上调)和反向(下调)的差异cDNA文库.随机挑取文库中的多个克隆用PCR方法进行鉴定,结果表明差异文库中的cDNA具有较好的多样性.本研究为下一步的文库克隆的序列测定与差异基因的功能分析奠定了基础.  相似文献   

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析     

姜一峰  周艳君  王亚欣  朱建平  徐彦召  童武  虞凌雪  童光志 《中国预防兽医学报》2012,34(1):1-5

为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。  相似文献   

猪源MHCⅡ类分子反式激活因子CIITA SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立     

朱豪杰  高飞  李丽薇  虞凌雪  张玉娇  张宽  童光志  姜一峰  李国新 《中国动物传染病学报》2022,(2):107-114

ClassⅡTransactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总cDNA中扩增CIITA基因,并克隆到pCold-TF载体...  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染肺泡巨噬细胞后差异表达膜蛋白的鉴定与分析     

张玉娇  高飞  曲泽慧  姜一峰  周艳君  虞凌雪  李丽薇  赵款  童光志 《中国动物传染病学报》2019,(3):1-8

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是危害养猪业发展的重要传染病之一。2006年我国首次爆发高致病性PRRS(highly-pathogenicPRRS,HP-PRRS),与经典的PRRS相比,HP-PRRS发病率和死亡率均显著升高。目前,对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly-pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)引起的高发病率和高死亡率的机制仍不清楚。本研究利用1MOI的EGFP标记的HP-PRRSV毒株HuN4(rHuN4-EGFP)和其体外传代致弱毒株HuN4-F112(rHuN4-F112-EGFP)分别感染肺泡巨噬细胞(pulmonaryalveolarmacrophage,PAM),24h后通过流式细胞术,从FITC通道收集被PRRSV强弱毒感染的PAM,提取膜蛋白进行Shotgun质谱分析。试验最终获得82个在强弱毒感染PAM过程中存在差异表达的膜蛋白。感染rHuN4-EGFP的样品与未感染样品相比,有72个蛋白特异表达;感染rHuN4-F112-EGFP的样品与未感染样品相比,有12个蛋白特异表达。通过GO分析发现,这些蛋白主要参与代谢、生物调节与细胞加工过程,大多数蛋白具有结合、催化活性。进一步在MARC-145细胞上过表达部分差异膜蛋白,发现其中前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein coverteases subtilism/kexin 9,PCSK9)能明显抑制PRRSV强毒株和弱毒株的复制,Clusterin、Apoliprotein C-II能促进PRRSV强毒株复制。本研究表明利用Shotgun质谱技术鉴定出的差异表达膜蛋白对PRRSV复制有影响,深入分析PRRSV感染后差异表达的膜蛋白变化将有利于进一步明确其致病机制。  相似文献   

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株主要囊膜糖蛋白GP5的遗传变异分析   总被引：5，自引：0，他引：5  

安同庆  田志军  肖燕  姜一峰  韦天超  彭金美  周艳君  仇华吉  童光志 《中国预防兽医学报》2008,30(11)

为了探究高致病性猪蓝耳病病毒（HP-PRRSV）的遗传变异特征,本研究对GenBank中235株HP—PRRSV GP5序列的遗传进化、主要氨基酸基序、抗原性以及N-糖基化位点数量和位置的变异进行了分析。结果表明HP-PRRSV之间的同源性较高,与其他参考毒株相比,这些病毒处于一个相对独立的分支中,而且与经典疫苗株的亲缘关系较远。这有助于解释经典疫苗株对于HP—PRRSV为何起不到理想的免疫保护效果。在病毒的中和表位序列中存在着规律的点突变,同时抗原性比较显示HP-PRRSV与经典毒株之间存在着一定的差异。绝大多数的HP-PRRSV的N-糖基化位点在数量上多一个,而且位置要向羧基端平移2个氨基酸,从而使得中和表位两侧直接与糖链相连,可能会造成中和表位被糖侧链所遮掩,本研究由此推测减弱中和抗体对HP-PRRSV的有效识别,促进病毒逃避机体体液免疫。  相似文献   

表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究     

童武  周艳君  徐彦召  姜一峰  王亚欣  张善瑞  朱建平  虞凌雪  孙晶  陈焕春  童光志 《中国预防兽医学报》2012,(7):505-509

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征病毒强/弱毒感染PAM细胞生物学特性比较分析     

朱建平  周艳君  王亚欣  虞凌雪  吴玉璐  童武  姜一峰  朱礼倩  于海  童光志 《中国动物传染病学报》2012,(1):32-37

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强、弱毒株在PAM细胞上的增殖特性,本研究在体外分离培养了健康猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),然后分别用高致病性PRRSV强毒HuN4株和弱毒疫苗HuN4-F112株感染PAM细胞,细胞病变观察和间接免疫荧光检测结果显示,二者在体外均可以感染PAM细胞,其中强毒HuN4株感染PAM细胞CPE较为明显。在两个毒株感染PAM细胞后12、24、36、48、60h分别收获病毒感染的细胞,利用抗PRRSV N蛋白单抗进行Western blot分析检测病毒核蛋白在不同时间表达量的变化,结果表明,强毒株在感染PAM细胞的早期,N蛋白合成表达量明显高于弱毒疫苗株,而弱毒疫苗株在感染Macr-145细胞早期,N蛋白的合成量则明显优于强毒株。比较HuN4株与HuN4-F112株在PAM细胞和Marc-145细胞的生长曲线,结果显示强、弱毒在PAM细胞和Marc-145细胞生长趋势存在明显差异,其中强毒HuN4株在PAM细胞上增殖能力明显强于弱毒株,而弱毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上的增殖能力明显强于其在PAM细胞上的增殖能力,表明PRRSV强毒株对靶细胞PAM的感染能力较强,弱毒疫苗株对其感染能力相对较弱。本研究为深入了解PRRSV强毒株与弱毒疫苗株的致病性差异提供了理论依据。  相似文献   

仔猪感染猪轮状病毒的鉴定及基因分析     

苏雪  侯怡轩  王康  虞凌雪  程群  谢春  姜一峰  杨志彪  李云章  童光志  周艳君 《中国动物传染病学报》2014,(2):20-26

为弄清2013年年初上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,本研究随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测。结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒阳性,而猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。根据GenBank公布的猪轮状病毒参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析。结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356 bp,VP7基因大小为1100 bp;序列分析结果显示,VP6基因与A群代表株OSU的氨基酸同源性为64.1%~87.0%,与代表株Gottfriend的氨基酸同源性为26.3%~60.8%;VP7基因与不同G型代表株的氨基酸同源性为71.8%~97.3%。根据上述结果分析,我们推测引起此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的猪轮状病毒引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。  相似文献   

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定   总被引：1，自引：1，他引：0  

张善瑞  周艳君  朱建平  童武  姜一峰  童光志 《中国预防兽医学报》2011,33(7)

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台.  相似文献