犬瘟热病毒血凝蛋白在昆虫细胞中的表达与抗原性分析     

全传松  姜骞  于作  李博韬  李连峰  曲连东 《中国畜牧兽医》2014,41(8):25-29

为获得具有天然构象及良好抗原性的犬瘟热病毒（CDV）血凝蛋白（H）,本研究以HLJ2-07毒株为模板,利用RT-PCR方法扩增出H基因,将其克隆到pFastBac^TMHTA载体中,利用大肠杆菌DH10Bac^TM同源重组构建穿梭质粒reBACmid-rH,将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,进行杆状病毒表达。利用Western blotting对获得的重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。同时,利用在线网站与软件对CDV H蛋白进行B细胞表位分析预测。结果显示,在杆状病毒系统中表达的H蛋白能与His-tag单克隆抗体及CDV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白成功表达,且具有良好的反应原性;用Swiss-model同源建模软件及B细胞表位预测软件,预测H蛋白可能具有的B细胞表位有5处,分别是175-195、240-250、365-380、480-508及526-555。本研究获得了具有天然构象及良好抗原性的CDV重组H蛋白,可为诊断试剂开发、单克隆抗体制备及表位筛选等工作奠定基础。  相似文献   

猪圆环病毒Cap蛋白羧基端特异性单克隆抗体的制备     

马贯中  韩凌霞  朴范泽  刘怀然  司昌德  姜骞  曲连东 《黑龙江八一农垦大学学报》2006,18(2):61-64

利用IPTG诱导表达含有猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白羧基端421-37nt的重组大肠杆菌pGEX-PCV421-37,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)粗分离,免疫BALB/c小鼠,利用PCV2感染PK15细胞筛选PCV2特异性单克隆抗体.共获得5株,腹水的IFA效价范围为1:1 600～1:8 000;除单抗26H5-A3为IgG1亚型外,32A8-G5、33G10-F4、12B5-G3和14E12-A6全部为IgM型;全部轻链都属κ型.  相似文献   

支气管败血波氏杆菌Δhfq突变株构建及生物学特性分析     

翟莹  郭东春  王林柏  刘家森  田进  刘春国  刘大飞  姜骞  曲连东 《中国预防兽医学报》2015,(2):101-105

为研究Hfq蛋白在支气管败血波氏杆菌(Bb)的致病作用,本研究采用同源重组技术,将卡那霉素抗性基因替换Bb122株的hfq基因,构建BbΔhfq突变株。将其连续传20代,Δhfq突变株具有良好的遗传稳定性。生化检测试验表明,突变株与亲本株未发生明显改变。此外,在37℃培养时,突变株与亲本株生长曲线无明显差异,但在42℃培养时,突变株的生长曲线略低于亲本株。抗逆性试验表明,突变株与亲本株在紫外线照射和50℃条件下,亲本株的耐受能力均显著高于突变株(p0.05)。然而,将亲本株与突变株分别以2×109cfu/只腹腔接种小鼠时,亲本株接种小鼠全部死亡,而突变株接种小鼠则全部存活,表明Hfq蛋白与该菌的致病性有关。本研究为进一步研究Hfq蛋白的功能及其在Bb致病机制中的作用奠定了基础。  相似文献   

口蹄疫诊断技术的研究进展     

姜骞  曲连东  李春艳  林欢  胡晓亮 《黑龙江畜牧兽医》2011,(9):31-33

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,该病传播速度快,宿主范围广,发病率高,主要侵害猪、牛、羊等70多种家畜和野生动物,人对其也敏感,给养殖业造成巨大的经济损失,世界动物卫生组织( OIE)将其列为A类传染病之首.口蹄疫病毒基因组为单股正链RNA,约有8 500个核苷酸,病毒...  相似文献   

犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

姜骞  李慕瑶  刘家森  司昌德  葛艳华  郭东春  韩凌霞  孟庆文  曲连东 《中国预防兽医学报》2009,31(2)

本研究以纯化的犬细小病毒(CPV)重组VP2蛋白为包被抗原,建立了检测CPV抗体的间接ELISA 方法,其抗原包被浓度为0.158μg/mL;待检血清稀释倍数为1:100,作用时间为60 min;羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1:2 000,作用时间为60 min;底物作用时间为10 min;判定标准为S/P≥O.282时为阳性,S/P≤0.226时为阴性.该方法与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬副粘病毒病、犬波特氏杆茵痛等4种犬常见传染病阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于15%,显示该方法具有良好的重复性;与商品化CPV ELISA试剂盒进行比较,符合率为96.5%.本研究为现地免疫犬群抗体监测和进行CPV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.  相似文献   

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达   总被引：1，自引：0，他引：1  

胡森  姜骞  师东方  李勐  于天飞  王君伟 《中国兽医杂志》2005,41(2):3-6

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。  相似文献   

猪传染性胃肠炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗体应答   总被引：2，自引：0，他引：2  

师东方李一经  唐丽杰姜骞王君伟  贾永清马波 刘宝全 《中国兽医科技》2003,33(8):31-34

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组质粒pHN为模板，Li-15和Li-2为上、下游引物扩增出TGEVTH98／N基因。将N基因与真核表达载体pcDNA3．1( )分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后连接，构建了重组真核表达载体pcDNA—N。将昆明鼠随机分为2组，分别肌肉注射pcDNA—N和pcDNA3．1( )，每只鼠100μg，共免疫3次，每次间隔2周。首次免疫后第0、14、21、28、35、39、47和54d采血分离血清，采用ELISA检测抗体动态变化。注射pcDNA—N组小鼠在首次免疫后第39d检测到针对TGEVN蛋白的阳性抗体。  相似文献   

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选     

穆亚芳  刘家森  郭东春  李茂中  原冬伟  姜骞  林欢  曲连东 《中国预防兽医学报》2011,33(5)

为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞.以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆.测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等.本研究鉴定的与RHDV VP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础.  相似文献   

口蹄疫诊断技术的研究进展     

胡晓亮  林欢  姜骞  李春艳  曲连东 《黑龙江畜牧兽医》2011,(17)

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,该病传播速度快,宿主范围广,发病率高,主要侵害猪、牛、羊等70多种家畜和野生动物,人对其也敏感,给养殖业造成巨大的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。口蹄疫病毒基因组为单股正链RNA,约有8 500个核苷酸,病毒衣壳由4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)组成,其中VP1和VP3是主要免疫性抗原。口蹄疫病毒具有7个血清型,即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaⅠ,每个血清型又  相似文献   

多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

许腾林  邢桂玲  刘家森  刘大飞  李志杰  姜骞  康洪涛  田进  郭东春  曲连东 《中国预防兽医学报》2018,(8)

为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10~1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10~3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。  相似文献