猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达   总被引：5，自引：1，他引：4  

祝卫国宋长绪  王贵平杨增岐 黄忠李春玲  王旭荣 《中国兽医科技》2004,34(12):3-6

应用PCR扩增猪2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因，将PCR产物用K pn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后与同样处理过的pBAD／g ⅢB载体连接，转化TOP10细胞后挑取阳性克隆，酶切鉴定和测序后，用L-阿拉伯糖诱导，经SDS-PAGE和Western-blotting分析，表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达，表达的多肽为28 ku。  相似文献   

猪红斑丹毒丝菌GZ株的分离鉴定及序列分析     

张乐宜  蔡汝健  蒋智勇  宋长绪 《西北农业学报》2014,23(7):31-38

2013年11月从广州某猪场发生急性败血症死亡的母猪心脏、肺脏、脾脏分离到1株病原菌,经形态学观察、培养特性、生化特性及16SrRNA、spaA基因测序,确定为猪红斑丹毒丝菌,命名为GZ株。结果表明,该菌株对阿莫西林、利福平、庆大霉素、头孢类抗生素高度敏感,对其他药物广泛耐药,对BALB/c小鼠的致死剂量为1.5×108 cfu/mL。测序结果与NCBI收录的猪红斑丹毒丝菌进行Blast比对分析,16SrRNA基因与不同地区分离自人、蛋鸡、猪、白海雕、野猪、野兔、鼠等动物的同源性为95.9%~99.8%。spaA基因与NCBI收录的分离菌株核苷酸同源性为98.9%~99.9%,氨基酸同源性为99.5%,3处发生突变,其中,第36位缬氨酸突变为亮氨酸,第203位异亮氨酸突变为蛋氨酸,第257位亮氨酸突变为异亮氨酸;与1998年和2006年日本1a型Fujisawa株的核苷酸同源性最高,为99.8%,因此确定分离的GZ株为1a血清型。  相似文献   

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达   总被引：5，自引：1，他引：4  

宋长绪  刘福安  杜伟贤 《中国兽医学报》1996,(6)

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物  相似文献   

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定     

宋长绪  刘福安  杜伟贤 《中国兽医学报》1997,(4)

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。  相似文献   

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的…   总被引：8，自引：4，他引：4  

宋长绪  杜伟贤 《中国兽医学报》1996,16(6):527-533

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒）、对病毒进行纯一提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆人ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ双酶切法、ＰｓｔＩ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，ａｑｔ  相似文献   

高热病猪群中PRRSV的调查及其流行毒株的分离   总被引：10，自引：0，他引：10  

王旭荣  马红艳  祝卫国  杨增岐  张春红  张彩勤  王建华  宋长绪 《中国兽医杂志》2008,44(3):39-40

中国大陆分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株均为美洲型,而对PRRSV欧洲型还没有系统的调查和病毒分离的报告.2006年暴发的高热病至今让养殖户和兽医人员记忆犹新,到底PRRSV在此次发病中的流行情况如何?  相似文献   

PRRSV流行株Nsp2、ORF5和ORF3基因序列的分析   总被引：1，自引：1，他引：0  

王旭荣  张彩勤  赵炳武  张春红  杨增岐  宋长绪 《动物医学进展》2008,29(12)

采用RT-PCR方法扩增2006年--2007年从江西、湖南、海南、广东等4省的不同猪场病猪体内分离的11株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因,并进行序列分析。结果表明,11个PRRSV流行株的Nsp2均发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1毒株相同;11个PRRSV流行株的ORF5、ORF3基因和JXA1相应序列的核苷酸同源性分别为99．2％～99．8％、99．1％～99．6％,氨基酸同源性分别为98．0％～99．5％、98．4％～99．6％;11个PRRSV流行株之间ORF5基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．8％～100．0oA、98．0oA～100．0％,其中5个流行株的ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．0％～99．6％、98．8％～99．69,6。根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这11个PRRSV流行株与JXA1株的亲缘关系很近。  相似文献   

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果     

刘建营  丛丽媛  赵路易  王建龙  王晶钰  徐维加  宋长绪 《中国兽医学报》2008,28(6)

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。  相似文献   

伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析     

白丽丽  王旭荣  刘建营  陈德坤  张春红  宋长绪 《中国动物检疫》2008,25(1):23-26

从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。  相似文献   

猪外周血单个核细胞增殖反应影响条件的探讨   总被引：8，自引：0，他引：8  

宋长绪  谢明权 《中国预防兽医学报》1999,21(4):289-290

应用 Ｌ１６ （４５） 正交试验, 对影响猪 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 增殖反应的几个因素, 包括培养时间、 Ｐ Ｈ Ａ 浓度、细胞浓度等三个因素四个水平进行了比较和探索。试验表明几个因素对 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 的增殖反应均有显著的影响（ Ｐ＜ ００５） , Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 增殖反应的 Ｍ Ｔ Ｔ 比色法的最佳反应条件组合为 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 浓度为１ ×１０６／ｍｌ, 植物血凝素 Ｐ Ｈ Ａ 的浓度为１２５μｇ／ ｍｌ, 细胞培养时间为２４ 小时; 影响增殖反应的先后顺序为 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 浓度、 Ｐ Ｈ Ａｐ 浓度及细胞培养时间。同时确定了最有利于 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 增殖的犊牛血清浓度为１０ ％ 。  相似文献