果子狸源H5N1亚型禽流感病毒的分离及生物学特性鉴定     

吴珊珊  王飞  慈彦鹏  刘丽玲  田国彬  曾显营  陈化兰  李雁冰 《中国预防兽医学报》2013,35(3)

2011年,对广西自治区进行禽流感流行病学调查时从野生哺乳动物果子狸体内分离到一株H5N1亚型禽流感病毒(AⅣ),命名为A/palm-civet/Guangxi/26/2011 (H5N1) (PC/GX/26/11).本研究对其全基因组序列进行测定及其对BALB/c鼠的致病性试验.全基因序列分析表明:该病毒属于Clade 2.3.2分支,其血凝素(HA)蛋白裂解位点存在多个连续的碱性氨基酸(-RRRR-),具有高致病性AIV (HPAIV)的典型分子特征,其HA、NA、PA、NS基因节段与A/muscovy duck/Vietnam/LBM57/2011 (MD/VN/LBM57/11) (H5N1)有较高的同源性,为99.2％～99.6％;PB2、PB1、M、NP4个基因节段与人源AIV A/Hubei/1/2010 (HuB/1/10) (H5N1)的同源性最高,为99.0％～99.5％.动物试验显示:该病毒对小鼠的半数致死量为4.9 log EID50,对小鼠具有较高的致病性.在小鼠的肺和鼻甲骨中均能够进行良好的复制.以上结果表明,该分离株未经适应便具备感染哺乳动物并有较高致死的能力.  相似文献   

鸭IFN-γ,IL-2mRNA荧光定量RT-PCR方法的建立及应用     

张盼涛  曾显营  杨婧  李倩倩  田国彬  陈化兰 《中国预防兽医学报》2013,35(6)

为评价疫苗免疫对鸭细胞免疫应答反应的影响,本研究提取鸭脾脏组织总RNA,采用鸭IFN-γIL-2、GAPDH基因特异性引物,建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)方法.结果显示IFN-γ、IL-2、GAPDH基因扩增标准曲线相关系数均高于0.99;3者扩增效率相近,均接近于100％;融解曲线呈特异性单峰;各基因组内和组间变异系数均小于2％.应用该方法检测不同佐剂禽流感灭活疫苗免疫樱桃谷鸭后脾脏组织IFN-γ和IL-2 mRNA的相对表达水平.结合免疫后抗体水平及攻毒保护结果,比较不同佐剂对禽流感灭活疫苗免疫应答的影响.结果显示,金黄色葡萄球菌毒素A重组蛋白(rSEA)佐剂组IFN-γ和IL-2 mRNA表达水平显著高于其他免疫组(P＜0.05).结果表明,建立的qRT-PCR特异性、重复性和稳定性良好,能够快速、准确检测鸭体内细胞因子的表达水平,为进一步评价疫苗免疫效果奠定了基础.  相似文献   

不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究     

赵双成  柳金雄  陈普成  曾显营  葛金英  乔传玲  田国彬  姜永萍  陈化兰 《中国农业科技导报》2014,16(1):46-51

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)\[GS/GD/96\]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8 μg HA/0.3 mL（肌肉注射）、103PFU/100 μL（刺种）、106EID50/100 μL（滴鼻、点眼）、15 μg/200 μL（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒（HPAIV） GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护（不发病、不致死、不排毒）;在病毒攻击前,灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）所诱导的HI抗体平均水平分别为875log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。  相似文献   

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立   总被引：3，自引：0，他引：3  

王云鹤  包红梅  孙佳善  李雁冰  徐晓龙  王子龙  施建忠  曾显营  王秀荣  陈化兰 《中国农业科学》2015,48(15):3050-3055

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。  相似文献   

H5N1亚型禽流感病毒对鹌鹑的致病性及接触传播能力研究简     

李倩倩  曾显营  白洁  邓国华  李雁冰  刘丽玲  施建忠  陈化兰  田国彬 《中国预防兽医学报》2014,(2):94-97

  相似文献   

兼顾H5亚型高致病性禽流感病毒不同分支HA蛋白单克隆抗体的制备及鉴定     

徐海峰  张莹  刘琳  曾显营  谷琳琳  熊晓宇  王秀荣  陈化兰 《中国预防兽医学报》2018,(7)

为建立针对我国主要流行的H5亚型Clade7.2、Clade 2.3.2和Clade2.3.4.4分支高致病性禽流感病毒(HPAIV)不同流行株的免疫学快速检测方法,本研究将Clade7.2分支禽流感疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7)、Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(H5N1)(Re-10)混合作为免疫原免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫后无菌取其脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下融合,通过间接ELISA方法及HI试验筛选获得6株能稳定分泌抗血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能够与当前AIV流行的分支反应,具有较好的广谱性。本研究为H5亚型AIV快速诊断技术的研发提供基础材料。  相似文献   

不同杂交方式获得高效表达乙肝病毒基因转基因小鼠   总被引：1，自引：0，他引：1  

耿士忠  曾显营  鞠辉明  杨跃飞  成勇 《畜牧兽医学报》2005,36(7):744-746

转基因动物普遍存在转基因效率低、表达水平不高并且外源基因遗传不稳定等问题。根据传统育种原理，笔者在已经得到的转基因动物基础上，寻找比原代外源基因表达水平更高的后代，不仅可解决上述问题，而且可以节约成本，缩短获得高效表达转基因动物的时间。本研究是以繁殖周期短，易操作，较经济的小鼠作为试验模型，对已整合有人的乙肝病毒(Hepatitis B Virus，HBV)基因的小鼠进行近交和远交的方法进行选育，并对选育的后代进行外源基因的整合检测以及对小鼠血清中表达的外源基因进行定量检测，表明获得了高效表达的转基因小鼠，从而为以后的转基因动物研制提供了实践和科学依据。  相似文献   

H5亚型禽流感DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭免疫保护效力的研究     

李俊平  赵双成  常晓飞  柳金雄  曾显营  卫星辉  李福基  姜永萍  陈化兰 《中国预防兽医学报》2011,33(3)

为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情况。分别于攻毒后3d、5d和7d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离,检测鸭排毒情况及免疫和攻毒后血凝抑制(HI)抗体、中和(NT)抗体的动态变化。结果表明:30μg和50μg免疫组均可对免疫鸭产生100%保护,而20μg剂量组则可对免疫鸭提供80%保护。  相似文献   

AA肉鸡免疫禽流感油乳剂灭活疫苗细胞免疫应答的变化     

王彦妮  曾显营  田国彬  苏文  陈化兰 《中国预防兽医学报》2011,33(2)

为了解肉鸡生长期内免疫前后的细胞免疫反应,本实验采用CD3/CD4/CD8三色流式细胞术、MTT法和Griess法依次检测了AA肉鸡免疫禽流感灭活疫苗和非免疫状态下外周血、胸腺和脾脏中T淋巴细胞及其亚群的相对含量、外周血中T淋巴细胞对PHA-P的增殖反应能力和诱导巨噬细胞NO分泌量的变化。结果表明,非免疫状态下,AA肉鸡外周血CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞相对百分含量在7日龄时均为最低,脾脏中CD4+T淋巴细胞相对百分含量在整个试验期一直呈下降趋势,免疫后外周血、脾脏和胸腺中CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞相对百分含量均明显高于非免疫组,且脾脏CD4+T淋巴细胞呈阶段性上升状态;各时期淋巴细胞刺激指数(SI)值和巨噬细胞NO分泌量检测结果表明,免疫组均高于同期对照组(p<0.05)。研究结果还表明:肉鸡在7日龄时细胞免疫水平最低,灭活疫苗可以激发肉鸡产生较强的细胞免疫应答。  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒S1基因的真核表达及其产物的免疫原性   总被引：4，自引：0，他引：4  

焦红梅  焦新安  殷月兰  黄金林  潘志明  孙林  曾显营  顾志强 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2006,27(2):44-47

采用RT-PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M 41株的全长S1基因,并将其片段连接到pGEM-T载体,经酶切、PCR及序列测定表明,获得的S1基因ORF全长为1 659 bp,与G enB ank上公布的IBV M 41 S1基因序列一致。将S1基因与真核表达质粒pVAX 1连接,构建重组真核表达质粒pVAX 1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测转染细胞S1蛋白的表达。同时以重组质粒免疫小鼠,可诱导产生特异性针对IBV S1蛋白的抗体(P<0.01)。这为鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。  相似文献