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【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。 相似文献
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为建立一种简便、快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)抗体的间接ELISA方法,以表达和纯化的FAVI五邻体重组蛋白作为抗原,优化反应条件,建立了FAVI间接penton-ELISA抗体检测的方法。抗原最佳包被浓度为1.5μg/孔,最适包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;ELISA阴、阳性临界值为0.335。用penton-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为41%。 相似文献
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番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法。用该方法对同一样品中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的模板进行PCR扩增,结果均得到了与实验设计相符的351bp（鸭圆环病毒）和474bp（番鸭细小病毒）的扩增条带,而对鸭Ⅰ型肝炎病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性测定结果表明：该二重PCR技术最低能检出100fg的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA模板。研究建立的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭圆环病毒和番鸭细小病毒感染的检测。 相似文献
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本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清.用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记.利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法.结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体.用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光.用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致.表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测. 相似文献
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为了解广西地区血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的基因特征,本研究对实验室前期分离的一株FAdV-4（命名为GX2019-010）进行了全基因组测序,对所获核苷酸序列进行同源性比对和遗传进化分析,并进一步分析了主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列。结果显示,GX2019-010全长43 719 bp,GC含量为54.9%,主要包括43个潜在蛋白质编码区域。核苷酸序列同源性比对发现,GX2019-010与致病株MX-SHP95的同源性为95.8%,与非致病株ON1和KR5同源性分别为95.0%和95.2%。遗传进化分析显示,GX2019-010与中国FAdV-4近几年的流行毒株在同一分支,而与国外FAdV-4毒株不在同一分支,说明FAdV-4存在遗传差异,主要的差异存在于基因组的右端,国内分离株均出现1 966 bp的缺失,其中包括ORF19、ORF48和ORF27基因的缺失,说明中国流行的FAdV-4具有地域性。对主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列分析发现,3个主要结构蛋白均有氨基酸位点的突变,其中Fiber-2的突变位点最多。本研究丰富了广西地区FAdV-4的基因库,为今后心包积液-肝炎综合征（HHS）的防控及流行病学调查研究提供了参考依据。 相似文献
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为跟踪调查广西活禽市场新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的流行分布和分子演化特征,2018年在广西不同城市10个活禽市场随机采集鸡、鸭、鹅和鸽子泄殖腔和咽喉拭子样品2820份,通过病毒分离与F基因扩增和测序,分析其遗传进化特征。结果显示:从4种宿主中共分离得到54份NDV,包含CLASSⅠ基因1b亚型、CLASSⅡ基因Ⅰ型和CLASSⅡ基因Ⅻ型三种基因型,且发现同一宿主存在不同基因型混合感染的情况。CLASSⅠ基因1b亚型NDV占比最大(50/54,92.5%)。遗传进化分析显示,广西分离株与同基因型参考株处于不同的小分支,存在地域差异。 相似文献
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为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。 相似文献
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为了分析禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)后,对其细胞因子IL-17、IL-18和IFN-γmRNA转录水平的影响,探讨禽呼肠孤病毒感染机制和宿主之间的作用关系。本试验将ARV-S1133感染CEF细胞后,运用荧光定量PCR技术,测定和分析ARV结构蛋白σC和CEF细胞的IL-17、IL-18及IFN-γ的mRNA动态转录水平。结果表明,ARV-S1133感染CEF细胞10h后病毒结构蛋白σC mRNA的相对表达量开始迅速上升,在48h达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF细胞中的IL-17、IL-18和IFN-γmRNA表达量发生变化,IL-17和IFN-γmRNA转录水平在感染早期迅速上调,感染后6h达到第一个峰值,分别上调8.77倍和11.17倍,随后下降,在感染36、48、60h后大幅度上升,且在48h达到峰值,表达量分别为97.19倍和111.58倍。IL-18mRNA转录水平在整个感染过程中表达量较低,在感染6h后微量上调(1.39倍),在感染中后期,其表达量呈下调趋势,感染48h时,IL-18mRNA表达量最低,与对照组相比下调0.19倍;5个不同滴度的ARV病毒感染CEF细胞24h后,3个细胞因子mRNA的表达量与病毒滴度线性相关,IL-17和IFN-γmRNA转录水平与病毒滴度正相关,IL-18mRNA转录水平与病毒滴度负相关。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-17、IL-18、IFN-γ的mRNA转录水平上调,说明IL-17、IL-18、IFN-γ可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。 相似文献
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参照GenBank中禽源核苷二磷酸激酶2(NME2)基因序列,设计了NME2基因的特异性引物。采用RT-PCR扩增NME2基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-NME2。将构建好的重组质粒pEF1α-Myc-NME2转染DF1细胞后,采用间接免疫荧光和Western blot技术对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-NME2融合蛋白在DF1细胞内得到了正确表达。本研究为后续研究禽源NME2基因的功能奠定了基础。 相似文献