采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究   总被引：5，自引：1，他引：4  

谢芝勋  谢志勤 《中国兽医科技》2000,30(9):5-7

建立了检测鸡喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的二温式聚合酶链反应（二温式ＰＣＲ）,根据已报道的ＩＬＴＶ ＴＫ基因的序列,设计并合成了１对引物,用二温式ＰＣＲ对５株不同ＩＬＴＶ ＤＮＡ进行扩增。该对引物对５株ＩＬＴＶ ＤＮＡ均扩增出与预期大小相一致的６４７ｂｐ的扩增产物,而对新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等６种禽病病原体的扩增,  相似文献   

应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿 …     

谢志勤  谢芝勋 《畜牧与兽医》2000,32(5):4-6

根据鸡毒支原体（ＭＧ）、禽衣阿华支原体（ＭＩ）、鸡滑液囊支原体（ＭＳ）的基因文库,设计了３对分别与ＭＧ、ＭＩ、ＭＳ某段基因序列互补的引物。用这３对引物对同一样品种的ＭＧ、ＭＩ、ＭＳ ＤＮＡ模板进行多重聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增,结果均同时得到了３条特异性的大小与实验设计相  相似文献   

禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的克隆和表达     

任红玉  谢芝勋  谢丽基  王盛  黄娇玲  邓显文  谢志勤  罗思思  曾婷婷  张艳芳  范晴  张民秀 《中国动物检疫》2020,37(3):92-97

本研究参照GenBank中编码禽源热休克蛋白HSP70、HSP40和核糖体蛋白RL4等的基因序列,分别设计特异性引物,采用RT-PCR扩增HSP70、HSP40和RPL4基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40和pEF1α-Myc-RPL4;将构建好的重组质粒,转染HEK293T细胞后,采用间接免疫荧光和Western-blot技术,对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-HSP70、Myc-HSP40和Myc-RPL4融合蛋白在HEK293T细胞内得到了正确表达。本研究为后续禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的功能研究奠定了基础。  相似文献   

重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立     

谢志勤  ;谢芝勋  ;刘加波  ;庞耀珊  ;邓显文  ;谢丽基  ;范晴  ;罗思思  ;牟群  ;莫文胜 《广西农业科学》2014,(7):1291-1295

[目的]建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法,快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌,为净化牛结核病提供技术支撑.[方法]以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原,建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA,并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件.[结果]重组CFP-10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为：以8μg/mL重组CFP-10蛋白包为被抗原,37℃下包被1h,再以5％脱脂奶封闭1h,血清（一抗）经1∶200倍稀释后作用1h,然后以1：500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（二抗）作用1h.该间接ELISA的阴阳临界值为0.281,仅与牛分枝杆菌呈阳性反应,与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应;其敏感性能检测1：320倍稀释的血清,批内与批间的变异系数均小于5.0％.[结论]建立的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点,临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测.  相似文献   

家畜检疫安全溯源系统开发的研究与应用     

朱贤龙  黄夏  农英相  李紫伦  谭媛尹  唐小飞  李海波  磨敦华  黎伊宁 《中国动物检疫》2014,31(3):33-35

为了实现对家畜产品可追溯管理,加强质量安全监管,本研究通过采用动物标识、动物检疫合格证明信息和动物产地检疫电子出证、家畜屠宰检疫电子出证以及互联网等电子技术,构建了根据家畜屠宰前后的动物检疫合格证明信息进行对接而建立起来的家畜产品溯源模式,建立了经济、实用、有效的家畜检疫安全溯源系统。  相似文献   

鸡毒支原体(MG)地高辛探针的制备   总被引：5，自引：0，他引：5  

刘加波  谢芝勋  廖敏  邓显文  谢志勤  庞耀珊  唐小飞 《广西农业科学》2004,35(5):401-404

从带有鸡毒支原体(MG)732bp 16SrRNA DNA片段的重组质粒中回收．并制备出地高辛标记的MG DNA探针。其特异性检测结果表明．该探针能与MG不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应，而与对照NDV、ILTV、MS、MI和MM等病原抽提的核酸的杂交反应均为阴性。敏感性结果表明．该探针对MGDNA的最低检出量为1ng。应用该探针对人工感染MG的SPF鸡的咽喉棉试子进行检测，结果均出现杂交显色反应。表明所制备的探针用于MG的检测是可行的。  相似文献   

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定     

王盛  谢芝勋  黄莉  谢丽基  邓显文  谢志勤  刘加波  罗思思  曾婷婷 《中国农业科学》2015,48(9):1836-1844

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。  相似文献   

禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

韦悠  谢芝勋  刘加波  谢丽基  庞耀珊  邓显文  谢志勤 《畜牧与兽医》2011,43(10)

采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。  相似文献   

鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立     

邓显文  谢芝勋  谢志勤  刘加波  庞耀珊  谢丽基  彭宜  范晴 《家畜生态》2011,(6):57-60

为建立一种能快速检测鸡传染性贫血病毒病（CIAV）的检测方法,根据基因库中鸡传染性贫血病毒病的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,建立了CIAV的LAMP可视化检测方法。该法敏感性可迭10fg,高于常规PCR方法10倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸡常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于CIAV感染的快速检测。  相似文献   

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究   总被引：6，自引：0，他引：6  

廖敏  谢芝勋  谢志勤  刘加波  庞耀珊  邓显文  唐小飞  何竞铭 《中国预防兽医学报》2003,25(1):53-55

根据已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列，设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株，分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增，即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物，而对照样品的扩增全为阴性；该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA，还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA，表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。  相似文献