罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析   总被引：1，自引：0，他引：1  

唐小飞  谢芝勋  邓显文  余晓丽  刘加波  庞耀珊  谢志勤  谢丽基 《水利渔业》2008,28(3):101-103

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1 335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性.应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5.  相似文献   

猪圆环病毒2型广西株的分离和全基因组序列分析     

唐小飞  谢芝勋  刘加波  邓显文  庞耀珊  谢志勤  谢丽基 《动物医学进展》2007,28(10):12-16

从广西表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪群中分离到1株猪圆环病毒2型(PCV-2),命名为GXB株.对GXB株的全基因组进行PCR扩增,扩增产物克隆至PMD18-T载体.测序结果表明,全基因组为1 767 bp,与GenBank上已知的8株PCV-2参考株序列的同源性在95.0%～99.6%之间.序列分析表明,GXB株基因组包含11个读码框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的读码框,分别编码314个和233个氨基酸,与其他PCV-2毒株的ORF1、ORF2氨基酸的同源性分别为97.8%～100%、91.5%～98.7%.对GXB株ORF2编码的Cap蛋白基因进行功能分析,表明含有1个潜在的糖基化位点,3个明显的亲水区,有较强的抗原性和亲水性,为作为主要的免疫原性蛋白基因提供了依据.  相似文献   

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新需疫病毒,鸡传染性支气管炎病毒,鸡   总被引：12，自引：1，他引：11  

谢芝勋  谢志勤 《中国预防兽医学报》2000,22(6):443-446

本文建立了一种同时检测ＤＮＶ、ＩＢＶ、和ＭＧ４种病原体的多重ＰＣＲ技术。根据ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ的基因文库,设计了４对分别与ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ某段基因序列互补的引物,用这４对引物对同一样品中的ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＭＧＲＶＡ和ＤＮＡ模板进行多重ＰＣＲ扩增,结果均同时得到了４条特异性大小与实验设计相符的３１０ｂｐ（ＮＤＶ）、１７２０ｂｐ（ＩＢＶ）、６４７ｂｐ（ＩＬＴＶ）和７３２ｂｐ（ＭＧ）多重ＰＣＲ扩增带,而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ技术难检出１０ｐｇ的ＩＢＶ、１ｂｇ的ＮＤＶ ＲＮＡ模板和ＩＬＴＶ、１ｐｇ的ＭＧ ＤＮＡ模板。  相似文献   

采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究   总被引：5，自引：1，他引：4  

谢芝勋  谢志勤 《中国兽医科技》2000,30(9):5-7

建立了检测鸡喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的二温式聚合酶链反应（二温式ＰＣＲ）,根据已报道的ＩＬＴＶ ＴＫ基因的序列,设计并合成了１对引物,用二温式ＰＣＲ对５株不同ＩＬＴＶ ＤＮＡ进行扩增。该对引物对５株ＩＬＴＶ ＤＮＡ均扩增出与预期大小相一致的６４７ｂｐ的扩增产物,而对新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等６种禽病病原体的扩增,  相似文献   

应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿 …     

谢志勤  谢芝勋 《畜牧与兽医》2000,32(5):4-6

根据鸡毒支原体（ＭＧ）、禽衣阿华支原体（ＭＩ）、鸡滑液囊支原体（ＭＳ）的基因文库,设计了３对分别与ＭＧ、ＭＩ、ＭＳ某段基因序列互补的引物。用这３对引物对同一样品种的ＭＧ、ＭＩ、ＭＳ ＤＮＡ模板进行多重聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增,结果均同时得到了３条特异性的大小与实验设计相  相似文献   

禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的克隆和表达     

任红玉  谢芝勋  谢丽基  王盛  黄娇玲  邓显文  谢志勤  罗思思  曾婷婷  张艳芳  范晴  张民秀 《中国动物检疫》2020,37(3):92-97

本研究参照GenBank中编码禽源热休克蛋白HSP70、HSP40和核糖体蛋白RL4等的基因序列,分别设计特异性引物,采用RT-PCR扩增HSP70、HSP40和RPL4基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40和pEF1α-Myc-RPL4;将构建好的重组质粒,转染HEK293T细胞后,采用间接免疫荧光和Western-blot技术,对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-HSP70、Myc-HSP40和Myc-RPL4融合蛋白在HEK293T细胞内得到了正确表达。本研究为后续禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的功能研究奠定了基础。  相似文献   

重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立     

谢志勤  ;谢芝勋  ;刘加波  ;庞耀珊  ;邓显文  ;谢丽基  ;范晴  ;罗思思  ;牟群  ;莫文胜 《广西农业科学》2014,(7):1291-1295

[目的]建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法,快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌,为净化牛结核病提供技术支撑.[方法]以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原,建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA,并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件.[结果]重组CFP-10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为：以8μg/mL重组CFP-10蛋白包为被抗原,37℃下包被1h,再以5％脱脂奶封闭1h,血清（一抗）经1∶200倍稀释后作用1h,然后以1：500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（二抗）作用1h.该间接ELISA的阴阳临界值为0.281,仅与牛分枝杆菌呈阳性反应,与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应;其敏感性能检测1：320倍稀释的血清,批内与批间的变异系数均小于5.0％.[结论]建立的重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点,临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测.  相似文献   

鸡毒支原体(MG)地高辛探针的制备   总被引：5，自引：0，他引：5  

刘加波  谢芝勋  廖敏  邓显文  谢志勤  庞耀珊  唐小飞 《广西农业科学》2004,35(5):401-404

从带有鸡毒支原体(MG)732bp 16SrRNA DNA片段的重组质粒中回收．并制备出地高辛标记的MG DNA探针。其特异性检测结果表明．该探针能与MG不同毒株核酸抽提物起特异性杂交反应，而与对照NDV、ILTV、MS、MI和MM等病原抽提的核酸的杂交反应均为阴性。敏感性结果表明．该探针对MGDNA的最低检出量为1ng。应用该探针对人工感染MG的SPF鸡的咽喉棉试子进行检测，结果均出现杂交显色反应。表明所制备的探针用于MG的检测是可行的。  相似文献   

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定     

王盛  谢芝勋  黄莉  谢丽基  邓显文  谢志勤  刘加波  罗思思  曾婷婷 《中国农业科学》2015,48(9):1836-1844

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。  相似文献   

禽呼肠孤病毒感染SPF鸡后免疫器官中IL-18的定量检测     

张昆丽  谢芝勋  黄莉  谢丽基  刘家波  邓显文  谢志勤  范晴  罗思思 《广西农业科学》2015,46(1)

[目的]掌握禽呼肠孤病毒(ARV)感染SPF鸡后免疫器官中白细胞介素18(IL-18)的相对动态转录时相,为揭示ARV的致病机制奠定基础.[方法]利用鸡IL-18实时荧光定量PCR检测分析ARV感染对SPF鸡免疫器官中IL-18mRNA动态转录水平的影响.[结果]SPF鸡感染ARV后,免疫器官发育不良,其脾脏、胸腺、法氏囊重量均低于对照组.与对照组相比,除感染后21d的胸腺、法氏囊和35 d的脾脏、胸腺中IL-18表达下调外,其他时间点免疫器官中的IL-18均表达上调,且都在ARV感染后第1d达峰值,上调倍数分别为3.59(脾脏)、7.99(胸腺)和8.35(法氏囊)倍.[结论]ARV感染可导致IL-18转录时相发生变化,推断IL-18与ARV对免疫器官的损伤与免疫抑制相关.  相似文献