二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究   总被引：5，自引：0，他引：5  

刘加波  谢芝勋  唐小飞  邓显文  庞耀珊  谢志勤 《水利渔业》2007,27(4):99-100

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。  相似文献   

禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

韦悠  谢芝勋  刘加波  谢丽基  庞耀珊  邓显文  谢志勤 《畜牧与兽医》2011,43(10)

采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。  相似文献   

鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立     

邓显文  谢芝勋  谢志勤  刘加波  庞耀珊  谢丽基  彭宜  范晴 《家畜生态》2011,(6):57-60

为建立一种能快速检测鸡传染性贫血病毒病（CIAV）的检测方法,根据基因库中鸡传染性贫血病毒病的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增（LAMP）引物,建立了CIAV的LAMP可视化检测方法。该法敏感性可迭10fg,高于常规PCR方法10倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸡常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于CIAV感染的快速检测。  相似文献   

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究   总被引：6，自引：0，他引：6  

廖敏  谢芝勋  谢志勤  刘加波  庞耀珊  邓显文  唐小飞  何竞铭 《中国预防兽医学报》2003,25(1):53-55

根据已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列，设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株，分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增，即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物，而对照样品的扩增全为阴性；该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA，还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA，表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。  相似文献   

二温式PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌方法的建立与应用   总被引：9，自引：0，他引：9  

庞耀珊  谢芝勋  刘加波  邓显文  唐小飞  谢志勤 《广西农业科学》2006,37(2):203-205

为了探索简便、快速确诊猪传染性胸膜肺炎的方法,根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx IV基因序列,设计合成1对特异性引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测APP的方法。采用该方法对APP和其他6种猪病病原核酸进行检测,结果只对APP扩增出与预期大小相符的422bp DNA片段,而对其他6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该PCR最低可检出10pg的APP DNA。对送检的46份可疑病猪组织进行检测,结果有19份样品为阳性,27份为其他病原感染。  相似文献   

基于纳米材料的电化学免疫传感器检测H5N1亚型禽流感病毒的研究     

黄娇玲  谢芝勋  罗思思  谢志勤  谢丽基  刘加波  庞耀珊  范晴 《畜牧兽医学报》2013,(6):911-918

利用氧化石墨烯(GO)负载H5N1亚型禽流感病毒多克隆抗体(PAb-H5N1)及牛血清白蛋白(BSA)作为信号放大材料,构建一种新型电化学免疫传感器用于检测H5N1亚型禽流感病毒。结果表明:以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器的灵敏度比不用此纳米复合物作为信号放大的高256倍。以PAb-H5N1-GO-BSA纳米复合物作为信号放大材料构建的电化学免疫传感器对H5N1亚型禽流感病毒的检测限为2-15 HA unit·50μL-1,检测线性范围为2-15～2-8 HA unit·50μL-1。此传感器特异性好,灵敏度高,在病原微生物快速检测领域具有良好的应用前景。  相似文献   

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化     

谢志勤  谢芝勋  邓显文  谢丽基  庞耀珊  刘加波  范晴 《广西农业生物科学》2012,(4):360-365

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a（＋）为载体构建重组表达载体CFP-10／pET32a（＋）。重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经0．9mmol／LIPTG37。C诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS—PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni．NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95％,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。  相似文献   

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立     

谢志勤  张民秀  谢芝勋  范晴  罗思思  谢丽基  黄娇玲  王盛  曾婷婷  张艳芳  李孟  李丹  邓显文  刘加波 《中国兽药杂志》2020,54(9):1-9

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PRRSV和PCV2。  相似文献   

重组禽呼肠孤病毒S1133 σ3基因表达及其免疫原性研究     

谢志勤  谢芝勋  刘加波  庞耀珊  邓显文  谢丽基  彭宜  范晴 《南方农业学报》2012,43(8):1223-1226

[目的]构建禽呼肠孤病毒(ARV)S1133 σ3基因的真核重组质粒,研究其表达蛋白的免疫原性,为研发ARV基因疫苗奠定基础.[方法]采用RT-PCR对ARV S1133毒株的σ3基因进行RT-PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接后,转化大肠杆菌DH5α,然后提取重组质粒的DNA,经双酶切、PCR扩增鉴定和纯化.以阳性重组质粒pcDNA3.1-σ3免疫7日龄SPF雏鸡,同时设灭活S1133、表达σ3蛋白及生理盐水对照,二次加强免疫两周后,采用Western blotting检测鸡群血清抗体;并用S1133毒株进行攻毒,4 d后进行ARV检测.[结果]重组质粒pcDNA3.1-σ3的双酶切和RT-PCR扩增鉴定结果一致,均能扩增出约999 bp目的条带;免疫攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-σ3处理、灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理和生理盐水处理的病毒检出率分别为7.4%、3.7%、11.1%和29.6%,pcDNA-σ3处理与生理盐水处理的差异显著(P<0.05),但与灭活S1133处理、表达σ3蛋白处理的差异不显著(P>0.05);病毒检出部位最高是关节,其次是胸腺和肾脏,胸腺检出率为零.[结论]真核表达ARV S1133 σ3蛋白具有较好的免疫保护,可作为免疫抗原进行下一步的疫苗中和试验.  相似文献   

禽呼肠孤病毒δ2基因的真核表达及其免疫效果研究     

邓显文  谢芝勋  谢丽基  谢志勤  刘加波  庞耀珊 《湖南农业科学》2011,(1):126-129,133

采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒ARV S1133毒株和广西分离株R1的δ2基因,将δ2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体上,对获得的重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定.结果表明,插入的片段为δ2目的基因,插入的位置、大小和阅码框架均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒peDNA-S1133-δ2、...  相似文献