基于宿主诱导的基因沉默技术创制抗拟轮枝镰孢玉米自交系     

赫可伟  陈甲法  周子键  吴建宇 《中国农业科学》2021,54(9):1835-1845

【目的】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）是一种主要的病原真菌,侵染玉米可以导致穗粒腐病、茎腐病、苗期根腐病及引起种子腐烂。由拟轮枝镰孢引起的病害不仅影响玉米的产量和品质,而且其病原菌代谢过程中产生的伏马菌素等多种真菌毒素严重威胁了人畜安全。通过宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术创制抗拟轮枝镰孢的玉米种质,为玉米抗病育种提供新的优异抗源。【方法】通过同源克隆方法克隆可能与拟轮枝镰孢生长发育相关的关键基因,并通过体外转录获得相应的dsRNA片段;将不同基因的dsRNA与拟轮枝镰孢的分生孢子悬浮液预混后,用于后续的体外RNA沉默试验;对感病玉米自交系西502的种子进行消毒与接种,在培养皿中28℃避光培养48 h,调查种子的发病程度;在混有dsRNA的孢子悬浮液中加入葡萄糖,25℃培养24 h后,在显微镜下观察孢子萌发与菌丝生长情况;将三叶期的西502幼苗转移至预混dsRNA的孢子悬浮液中进行培养,7 d后观察苗期根腐病发病状况;通过种子鉴定与苗期鉴定体系,逐步筛选具有显著抑制效果的沉默靶标基因;合成筛选出的重点靶标基因片段,构建沉默载体并转化感病玉米自交系西502;对转基因株系的种子接种鉴定,验证转化玉米株系的抗性;提取接种后转基因种子的总RNA,对拟轮枝镰孢的靶标基因进行荧光定量分析,确定HIGS株系的沉默效果。【结果】从拟轮枝镰孢中克隆出18个与其生长发育相关的候选基因;通过种子接种鉴定,发现11个候选基因被沉默后,种子的发病等级极显著降低;进一步筛选出6个沉默后影响拟轮枝镰孢的孢子萌发和菌丝生长的候选靶标基因deo、Ras2、Dpdc、Hsp90、Frp1和Atg15;通过苗期接种鉴定,最后筛选出3个在体外具有显著抑制效果的沉默靶标基因deo、Atg15和Frp1;进而将3个靶标基因的特异区段人工融合成一段序列并构建沉默载体,获得转基因植株;鉴定发现转基因植株的T₂代种子对拟轮枝镰孢的抗性显著增强,且3个靶标基因的表达量均显著下降。【结论】拟轮枝镰孢基因deo、Atg15、Frp1与其生长发育密切相关,且沉默后能够显著提升玉米对拟轮枝镰孢的抗性。  相似文献   

水稻CSC11介导干热风/干旱诱导的钙信号调控雄蕊发育     

任志杰  李倩  孙钰佳  孔冬冬  刘良玉  侯聪聪  李乐攻 《中国农业科学》2021,54(10):2039-2052

【目的】水稻花期偶遇干热风/干旱,导致脆弱的生殖细胞快速失水,极大地降低产量,这一过程中钙离子作为通用的第二信使传导了干旱或其他逆境信号,但背后的分子机制尚不清楚。分析钙离子透过性胁迫反应阳离子通道家族（calcium-permeable stress-responsive cation channels,CSCs）基因的生理和分子功能,为研究作物干热风的感应机制提供新的理论基础和思路。【方法】采用电生理学和遗传学方法,利用双电极电压钳技术在水稻中鉴定得到一个具有典型特征的受体类-钙通道蛋白,名为OsCSC11,对其蛋白序列进行生物信息学和进化关系分析。运用qRT-PCR和GUS报告基因活性分析确认OsCSC11的表达模式,在拟南芥原生质体细胞和洋葱表皮细胞中瞬时表达OsCSC11-GFP融合蛋白,验证OsCSC11的亚细胞定位;同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得OsCSC11的突变体,并通过细胞学等手段分析突变体表型和相关生理功能。【结果】蛋白序列比对发现,OsCSC11具有CSCs家族成员典型的保守结构域DUF221,但与其他成员序列差异大,存在不同于其他成员的特异结构域（motif）属于独立的亚家族。OsCSC11主要在水稻的花药和叶片中表达,进一步分析发现全长OsCSC11处于静息状态,可被高渗透溶液激活;但是删除N端156氨基酸（TM1-3）之后的OsCSC11^ΔTM1-3具有组成型的通道活性,特异选择钙、镁二价阳离子;推测TM1-3是这类通道的受体结构域,感应干热风胁迫,而OsCSC11^ΔTM1-3区域负责钙信号产生。OsCSC11和OsCSC11^ΔTM1-3均定位在细胞质膜上,与其干热风的受体功能相适应。与野生型相比,功能缺失突变体oscsc11-1和oscsc11-2的雄蕊较小、花药表面蹙皱,整体多呈弯曲状态,花粉含水量较低,败育率高达60%—70%。【结论】OsCSC11是水稻感应短期干热风/干旱刺激、介导钙离子内流,调控花药水分状态和花粉发育的受体类钙通道,可能参与了水稻雄蕊应对干热风的原初感应过程。  相似文献   

基于叶片反射光谱估测水稻氮营养指数   总被引：1，自引：0，他引：1  

徐浩聪  姚波  王权  陈婷婷  朱铁忠  何海兵  柯健  尤翠翠  吴小文  郭爽爽  武立权 《中国农业科学》2021,54(21):4525-4538

【目的】基于叶片反射光谱建立快速、无损监测水稻氮营养指数（nitrogen nutrition index,NNI）的估算模型。【方法】2018—2019年开展2个水稻品种（徽两优898和Y两优900）及5个氮肥梯度（施氮量为0、75、150、225和300 kg·hm^-2,分别记为N₀、N₁、N₂、N₃、N₄）的田间小区试验,测定关键生育期不同叶位叶片反射光谱和植株NNI,构建多种光谱指数的水稻NNI监测模型。【结果】单叶及叶位组合的敏感波段均分布在540 nm的绿光波长处,其与近红外波段构成的窄波段比值指数SR（R₉₀₀,R₅₄₀）可较好反演水稻NNI。但不同叶位叶片窄波段比值指数与水稻NNI的预测精度表现不同,顶3叶（L₃）预测精度最好（R²=0.731,RMSE =0.130,RE=11.6%）,顶2叶（L₂）次之（R²=0.707,RMSE =0.136,RE =12.2%）,顶1叶（L₁）最差（R²=0.443,RMSE =0.187,RE =14.7%）;顶2叶和顶3叶组合平均光谱（L₂₃）的预测精度优于单叶水平和其他叶位组合（R²=0.740,RMSE =0.128,RE =11.5%）。再将窄波段比值指数SR（R₉₀₀,R₅₄₀）近红外与绿光区域分别重采样50 nm和10 nm,所构建的宽波段比值指数SR[AR_{（900±50）},AR_{（540±10）}]模型精度较SR（R₉₀₀,R₅₄₀）未明显降低,且在L₂₃水平下2个模型的模型精度和预测精度基本一致（R²=0.740,RMSE =0.128,RE =11.5%）。水稻NNI小于1时与产量呈线性的正相关关系（P<0.05）,大于1时产量趋于平稳。【结论】L₂和L₃叶片反射光谱为监测水稻NNI的敏感叶位,其中叶位组合L₂₃可提高模型预测精度。基于叶片反射光谱构建的多种波段比值指数（SR（R₉₀₀,R₅₄₀）和SR[AR_{（900±50）},AR_{（540±10）}]）可快速估测水稻NNI,从而为不同传感器对水稻氮营养指数估测监测研究提供了理论依据。  相似文献   

苦荞VQ基因家族的全基因组鉴定及其在叶斑病原与激素处理下的表达谱分析     

郑逢盛  王海华  邬清韬  申权  田建红  彭喜旭  唐新科 《中国农业科学》2021,54(19):4048-4060

【目的】VQ基因家族在植物生长、发育以及对生物或非生物胁迫反应中发挥重要功能。在全基因组尺度上,全面鉴定苦荞（Fagopyrum tataricum L. Gaertn.）VQ（FtVQ）基因家族,分析其在苦荞叶斑病原——互格链格孢（Alternaria alternata）和黑孢霉（Nigrospora osmanthi）侵染和防御相关激素——水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）处理下的表达模式,为深入解析苦荞VQ基因家族在植物抗病防御中的功能及机理奠定基础,同时为优良基因资源发掘及抗病品种改良提供线索。【方法】基于VQ保守结构域的隐马尔可夫文件（PF05678）,采用HMMER 3.0对苦荞平苦一号基因组数据库进行比对搜索,鉴定VQ基因;通过DNAMAN、MapInspect、MEGA、MEME、OrthoFinder、PLACE等生物信息学工具分析基因结构、染色体分布、启动子顺式元件、蛋白质理化性质、蛋白质保守基序、蛋白质亚细胞定位和蛋白质系统进化关系;采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法分析苦荞叶VQ基因在病原侵染或激素处理下的表达模式。【结果】从苦荞基因组中鉴定获得28个VQ基因,大小为566—1 454 bp,均无内含子,不均一地分布在8条染色体上。根据它们在染色体上的物理位置,命名为FtVQ1—FtVQ28。每一个FtVQ蛋白含有1个VQ基序——FxxxVQx（L/F/I/V/A/Y）TG（x代表任意氨基酸）。亚细胞定位预测表明,21个FtVQ蛋白定位在细胞核中,其余定位在叶绿体或细胞质中。根据蛋白质氨基酸序列与保守结构基序,FtVQ蛋白归类于5个亚家族,亚家族内基因结构和蛋白质基序相对保守。基因重复分析表明,苦荞基因组中有8对VQ旁系同源基因,均为大片段重复基因,提示大片段基因重复在FtVQ基因家族数量扩张中发挥主要作用;它们的非同义突变和同义突变的比值（Ka/Ks）均小于1,提示重复基因在进化中经历了纯化选择。启动子顺式元件预测表明,所有FtVQ基因启动子含有BIHD1OS、CGTCA、ERELEA4、W-box和类W-box等病原或SA、JA、ET反应元件,尤其在FtVQ10、FtVQ14、FtVQ15、FtVQ22、FtVQ23、FtVQ27的启动子区域密集程度更高。qPCR分析显示,在可检测的20个FtVQ基因中,有55%—70%的基因为病原或激素处理下的差异表达基因（DEGs）,其中72.7%—85.7%的DEGs的表达显著上调。【结论】苦荞基因组拥有28个VQ基因成员,部分VQ基因可能参与了苦荞对叶斑病原的抗性反应。  相似文献   

基于BSA-Seq技术的甜瓜抗霜霉病InDel标记开发     

凌悦铭  李寐华  杨永  杨文莉  范蓉  伊鸿平  张红  张学军 《新疆农业科学》2021,58(12):2265-2273

目的 获得与甜瓜抗霜霉病基因连锁的分子标记或功能标记,用于甜瓜分子标记辅助选择育种。为进一步克隆甜瓜抗霜霉病主效基因奠定基础。方法 以野生高抗霜霉病资源DM-4和感病自交系DM-2为亲本,构建F₂代分离群体,利用BSA-seq对甜瓜抗霜霉基因进行QTL定位,开发InDel分子标记,并在双亲及其F₂群体单株进行筛选验证。结果 甜瓜抗霜霉病主效QTL位于第9号染色体。在候选区间开发了37个InDel分子标记,有9个PCR产物大小在抗、感双亲表现出差异,用F₂单株验证,结合田间表型鉴定结果,引物InDel 15和InDel 20准确率分别为95 %和98 %,引物InDel 15和InDel 20在抗病亲本中扩增产物大小分别为251和349 bp,在感病亲本中分别为231和324 bp。结论 引物InDel 15和InDel 20可以作为分子标记进行抗霜霉病辅助选育,加快了甜瓜抗霜霉病育种速度。  相似文献   

地钱部分MYB家族基因在不同发育时期、部位以及激素处理下表达量差异分析     

高旭东  傅晶  崔洪昌 《西北农业学报》2021,(1):109-115

为了研究植物适应陆地生活的机制,以较原始的陆生植物地钱(Marchantia polymorpha L.)作为研究对象,分析其部分MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族基因在不同发育时期,不同部位以及不同激素处理下的表达量变化。构建系统进化树确认地钱与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中MYB转录因子亚家族S14、S28和 AtCDC5 同源的基因,使用qRT-PCR对不同生长时期、组织以及激素处理下目的基因表达量进行分析。qRT-PCR分析结果表明, MpR2R3-MYB20在胞芽中表达量最高,胞芽杯中最低,且在0.1μmol/L IAA诱导下表达量显著上调; MpR2R3-MYB8在分生区高表达,激素处理下表达量变化较小;MpR2R3-MYB3和 MpCDC5在3周分生区高表达,IAA处理后下调; MpR2R3-MYB18主要在胞芽和胞芽杯中表达,且受ABA诱导大幅上调; MpR2R3-MYB16在全株中都有较高表达,在0.1μmol/L IAA处理下显著上调,在其他激素处理下显著下调。这些结果说明上述基因在地钱不同器官或组织中具有调节生长、发育和抗逆的重要功能。  相似文献   

基于转录组的苋菜LBD基因家族鉴定及蓝光下的表达分析     

王乐  陈何  肖昉  郑友峰  黄瑞丹  刘生财 《中国农业大学学报》2021,26(10):66-80

为了解苋菜LBD基因家族,本研究利用转录组数据筛选和鉴定苋菜LBD基因家族成员,并命名为AtrLBD。结果表明:1)从‘全红’苋菜转录组中共鉴定得到16个AtrLBD基因,均为不稳定蛋白,氨基酸长度在91～351aa,相对分子质量为9.396～38.250ku;二级结构主要以α-螺旋和无规卷曲为主;亚细胞定位预测,AtrLBD定位在细胞核、叶绿体和线粒体;MEME分析结果表明,16个AtrLBD共有10个保守氨基酸序列;2)系统进化树显示,16个AtrLBD与拟南芥LBD蛋白分为第一类(ClassⅠ)和第二类(ClassⅡ)2大类,细分为Class Ia、Ib、Ic、Id、Ie和Class IIa、IIb等7个亚类;miRNA预测结果显示,有4个AtrLBD是miRNA靶基因;3)qRT-PCR结果显示,除AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD10和AtrLBD16以外,AtrLBD均受到蓝光的诱导表达。上述结果为深入研究苋菜LBD基因家族的功能及进化分析奠定了基础。  相似文献   

散鳞镜鲤、团头鲂及其杂交F1肌肉营养成分的比较   总被引：3，自引：0，他引：3  

马波  金万昆 《水产学杂志》2004,17(2):76-78

采用生化分析方法对散鳞镜鲤、团头鲂及其杂交F1肌肉的营养成分进行了测定并比较。结果表明，交杂种F1肌肉中的水分含量为77．89％、灰分含量为5．52％，均低于亲本；脂肪含量为4．77％，高于团头鲂，低于散鳞镜鲤；F1的氨基酸含量为77．89％，低于双亲，但大多成分含量与散鳞镜鲤相当。在总体水平上，杂交种品质得到初步的改良。  相似文献   

Feed discrimination and selection in self-fed European sea bass Dicentrarchus labrax L.     

M Paspatis  D Maragoudaki  & M Kentouri 《Aquaculture Research》2002,33(7):509-514

Abstract This study was conducted to evaluate feed discrimination and preference of European sea bass Dicentrarchus labrax L., taking into account the effects of feed location, previous feeding experience and light conditions. Fish (63 g) were held in tanks and exposed to a 12L:12D photoperiod and ambient temperature. The following feeding practices were applied in triplicate: three‐choice feeding (self‐ feeding with feeds formulated for carnivorous, herbivorous and omnivorous fish rotated on a weekly basis) and monofeeding (self‐feeding with one of these feeds). After 9 weeks (phase I), fish previously held in monofeeding, were subjected to three‐choice feeding for 2 weeks (phase II). In phase I, fish discriminated between feeds after their rotational displacements and preferred the feed formulated for carnivorous species. This also supported the best growth. Fish used in phase II preferred the same feed. There was no preference for any location within tanks. Feeding was generally diurnal, although in some tests with the feeds for herbivores and omnivores, diurnal and nocturnal feed demands were similar and fewer in number than with the feed formulated for carnivores.  相似文献   

In vitro effects of Musa x paradisiaca extracts on four developmental stages of Haemonchus contortus     

C. Marie-Magdeleine  L. Udino  L. Philibert  B. Bocage  H. Archimede 《Research in veterinary science》2014

This study was carried out to evaluate the in vitro effect of Musa x paradisiaca stem and leaf against the parasitic nematode of small ruminants Haemonchus contortus. Three extracts (aqueous, methanolic and/or dichloromethane) of Musa x paradisiaca stem and leaf were tested in vitro on four developmental stages of H. contortus using egg hatch assay (EHA), larval development assay (LDA), L3 migration inhibition assay (LMI) and adult worm motility assay (AWM). The highly significant (P < 0.0001) ability to stop larval development (inhibition >67% for each extract) and the negative effect of the dichloromethane extract of leaf on adult worm motility (43% of inhibition of motility after 24 h of incubation) compared to the negative controls, suggest anthelmintic properties of Musa x paradisiaca stem and leaf against H. contortus. The active principles responsible for the activity could be secondary metabolites such as terpenoid and flavonoid compounds present in the leaf and stem of the plant.  相似文献